試劑、試劑盒丙烯酰胺單體貯液Tris-甘氨酸緩沖液貯液電極緩沖液樣品緩沖液過硫醆銨濃縮膠緩沖液貯液分離膠緩沖液貯液

實驗步驟

一、垂直平板電泳的制膠

用于垂直平板電泳的凝膠通常被灌注在兩側有隔片的兩塊玻璃板之間。模具垂直放置，周圍用硅油（或其他密封物質）密封，或用夾子夾緊，以免膠液泄漏。溶液從頂部灌注。灌膠完成后從頂部插入梳子，以形成加樣孔。梳子寬度取決于玻璃板的寬度，梳子的厚度和凝膠的厚度取決于隔片的厚度。

在垂直電泳裝置上可以進行連續電泳或不連續電泳。它們的差別之一在于制膠方法的不同。連續電泳僅有分離膠，并且整個電泳使用相同緩沖系統，所以灌膠是極為方便的。不連續電泳需要先灌注分離膠（均一膠或梯度膠），再灌注濃縮膠，需要掌握一定的技術。垂直電泳用的灌膠模具種類繁多，應根據說明書使用。常用的連續電泳的凝膠配方，貯液配置如下：

1. 丙烯酰胺單體貯液
11.1 g 丙烯酰胺 + 0.3 g N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，先用 35 ml 雙蒸水溶解， 攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀釋至 50 ml，過濾。用棕色瓶，可在 4℃ 保存一個月。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體及溶液是中樞神經毒物，要小心操作。

2. Tris-甘氨酸緩沖液貯液（pH 8.9）
30.04 g 甘氨酸 + 1.0 g 疊氮鈉，用 1.5 L 雙蒸水溶解，用 Tris 滴定至 pH 8.9，再用雙蒸水稀釋至 2.5 L。

3. 電極緩沖液
1 份 Tris-甘氨酸緩沖液貯液 + 1 份雙蒸水。

4. 樣品緩沖液
1 ml Tris-甘氨酸緩沖液貯液 + 0.1 mg （或適量）溴酚藍 + 19 ml 雙蒸水。

5. 10% 過硫醆銨
0.1 g 過硫酸銨 + 1.0 ml 雙蒸水。使用前新鮮配制。

由 Ornstein 和 Davis 首先發展的不連續電泳（當時用于圓盤電泳）是將濃縮膠（非排阻性大孔凝膠）加在分離膠上，并且使用不同緩沖系統。所以需要分別灌注分離膠和濃縮膠。不連續電泳的凝膠配方，貯液配置如下：

1. 丙烯酰按單體貯液
14.55 g 丙烯酰胺 + 0.45 g N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，先用 35 ml 雙蒸水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀釋至 50 ml，過濾。用棕色瓶可在 4℃ 保存一個月。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體及溶液是中樞神經毒物，要小心操作。

2. 濃縮膠緩沖液貯液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8 )

3.03 g Tris 溶解在 40 ml 雙蒸水中，用 4 mol/L 鹽酸調至 pH 6.8。再用雙蒸水稀至 50 ml，保存在 4℃ 備用。

3. 分離膠緩沖液貯液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.9 )
18.16 g Tris 溶解在 80 ml 雙蒸水中，用 4 mol/L 鹽酸調至 pH 8.9。再用雙蒸水稀至 100 ml，保存在 4℃ 備用。

4. 10% 過硫酸銨
0.1 g 過硫酸銨 + 1.0 ml 雙蒸水。使用前新鮮配制。

5. 電極緩沖液
0.025 mol/L Tris，0.2 mol/L 甘氨酸，pH 8.3。
15.14 g Tris + 72.07 g 甘氨酸，用雙蒸水稀釋到 5 L?？稍谑覝乇４嬉粋€月。

6. 樣品緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8 )
2 ml 濃縮膠緩沖液貯液 + 1 ml 87% 甘油+ 0.1 mg 溴酚藍，用雙蒸水稀釋至 10 ml，可在 -20℃ 保存 6 個月。

按配方在模具中灌注分離膠后， 小心地在分離膠的表面加一層水（或水飽和的異丙醇或正丁醇)，封住膠面，以促使聚合并使凝膠表面平直。 凝膠在 30~40℃ 放置約 40 分鐘~1 小時后，可以看到一個界面，表示凝膠聚合。吸掉水（或水飽和的異丙醇或正丁醇)，用濃縮膠緩沖液貯液淋洗凝膠，然后灌注濃縮膠。并插入與模具大小相同，與凝膠厚度相當的梳子。為防止氣泡陷入，梳子應傾斜插入。然后讓模具再靜止放置在 30~40℃，聚合約 40 分鐘~1 小時。如果帶著梳子過夜可能會影響分辨率，所以濃縮膠最好在使用前再灌注。

如灌注線性梯度膠，則在灌注分離膠時需要用梯度混合器，有時還需要蠕動泵。梯度混合器分貯液腔（盛輕液）和混合腔（盛重液)。兩腔間有腔間閥。后者與出口相連接?；旌弦簭幕旌锨恢辛鞒觥８淖儍蓚€腔的大小或溶液配方，就能改變梯度的斜率。在貯液腔中插入凸形錐體（convex ) 或凹形錐體（convave) 就能形成指數梯度（指數梯度不常用）。梯度混合器的使用方法參見“水平平板電泳的制膠”。

二、水平平板電泳的制膠

水平電泳與垂直電泳的制膠方法在連續電泳時相同，不連續電泳時的制膠方式都為垂直灌注，差別只在于：

1. 垂直電泳用的凝膠在頂端用梳子形成加樣孔，而水平電泳可在凝膠聚合后在膠面上加樣或在凝膠上做加樣孔。

2. 垂直電泳必須先灌注分離膠，后灌注濃縮膠，以便插入梳子；水平電泳用的凝膠是平鋪在冷卻板上電泳的，所以可以先灌注濃縮膠，后灌注分離膠。且濃縮膠中加有甘油，所以不需等待聚合，便可接著灌注分離膠，使操作大為簡便。而且由于濃縮膠中的甘油使加樣孔中保有一定的水，所以對樣品的高鹽濃度不敏感，有時可以免去透析。

3. 垂直電泳是先灌注分離膠，所以底部的梯度膠濃度最大；而水平電泳是后灌注分離膠，所以頂部的凝膠濃度最大。這樣在聚合時不會有熱對流的干擾。 并且這種灌注法不會在小孔徑凝膠中有高濃度的甘油，可以避免在電泳時由于甘油吸濕而引起小孔的泡脹。

4. 垂直電泳制膠后，不需取膠，仍將膠置于玻璃板中電泳；但水平電泳需要將聚合后的凝膠從灌膠模具中取出，平鋪于冷卻板上進行電泳，因此電泳時冷卻效果較好。

5. 目前水平電泳用的凝膠厚度大多薄于垂直電泳。薄膠從分辨率，電泳時間, 靈敏度，保存方便，實驗材料的節省等方面都顯然優于厚膠，是當前發展的方向。

如果要在凝膠上做加樣孔，需要準備一塊可重復使用的小孔成型模板。模板通常是用不附著膠的玻璃板制作的。先用去污劑清洗玻璃板，然后用蒸餾水淋洗。用濾紙吸干，再用無水乙醇淋洗玻璃表面以去掉任何殘留的不純物。把玻璃板放在坐標紙上，貼幾層隔片帶在玻璃表面上，見圖 4.9。用一把銳利的刀去掉多余的隔片帶。在小孔成型條之間切成 2~3 mm 的小段。所加層的數目和條的寬度取決于樣品體積。小孔成型條的長條取決于計劃的加樣數。例如，加 5 ml 樣品，小孔成型條應該是兩層厚，2 mm 寬和 7 mm 長。小孔成型條制成的孔可加多至 100 μl 的樣品。

隔片帶可以用 DYMO 帶（一種不干膠帶）制作小孔成型條。如果凝膠厚為 1 mm，應在玻璃模板上貼兩層。如果凝膠厚為 0.5 mm，應貼一層。為了保持電流通過小孔，凝膠層應覆蓋在小孔底部最小厚度 0.2 mm。

小孔應做在濃縮膠和分離膠界面的濃縮膠一側，使小孔和陰極之間為均一的濃縮膠。

組裝模具前先將玻璃板洗凈，在不黏膠的玻璃板上涂一層不黏膠的硅烷。把黏膠的支持膜鋪在另一塊玻璃板上，用滾筒趕去氣泡和多余的水，用夾子夾好模具。為防止凝膠在灌注時聚合，應預先將模具放在 4℃ 冰箱中預冷。灌注線性梯度膠的貯液同不連續電泳，配方見表 4.7。先將一定量的輕液注入梯度混合器的貯液腔，小心打開腔間閥，趕去腔間氣泡，如有輕液流入混合 腔，需吸回貯液腔，關上腔間閥。再將重液注入混合腔，并加入攪拌子。梯度混合器應置于已調水平的磁力攪拌器的合適位置上，兩腔中的液面應該相平。每腔先各加入 TEMED，再加過硫酸銨。先打開腔間閥，再立即打開流出管的夾子, 兩腔中的液面應同時下降。梯度混合器與模具之間應有合適的高度差，使灌注在 1~5 分鐘完成。灌注后在室溫靜止 15 分種，再放在 30~40℃ 烘箱中聚合。聚合約需 1 小時完成。聚合后在 4℃ 至少放置 12 小時使其充分聚合，孔徑均勻后才可使用。梯度膠的灌注比較繁雜，但它可以分離復雜樣品。由于分子篩的作用，有較好的分辨率，且譜帶細窄。