一、 目的和要求
要求學會植物病原真菌、細菌、病毒和線蟲的分離、培養和接種的一般方法，并掌握其基本原理；學習植物傳染性病害研究中常用的接種方法，比較不同接種方法對病害發生發展過程與外界環境的差異。

二、材料和用具
新鮮的真菌和細菌病害材料（辣椒炭疽病果、水稻稻瘟病病葉片、水稻白葉枯病葉、煙草花葉病和番茄根結線蟲病等）；番茄青枯菌/番茄、水稻稻瘟菌/水稻幼苗、水稻白葉枯病菌/稻苗、煙草花葉病/煙草  噴霧器、紗布、酒精燈、酒精缸、火柴、接種餌（針）、長鑷子、玻棒、小木塊、解剖刀、刀片、載玻片、蒸餾水（滴瓶）、漂白粉精片兩研缸、漏斗、皺紋紙、毛筆、針、剪刀、三角瓶、試管、記號筆、標簽、金剛砂、保濕罩、彌霧機。70％乙醇、0．1％升汞、滅菌培養皿（吸管）、滅菌水、滅菌培養基（PDA和NA）。
三
、內容與方法
3．1 病原真菌的分離和培養 植物病原微生物分離和培養工作應該在專門的無菌操作室或超凈工作臺上進行，但是亦可在清潔和安靜的房間中進行。工作時在桌面上鋪一塊沾濕的紗布，所有工作用具放在濕紗布上，盡量少在室內走動，減少空氣流動，以減少污染。選用的分離材料應盡量新鮮，減少腐生菌混入的機會。從受病組織邊緣靠近健全組織的部分分離，可減少污染，同時這部分病原生物處于較為活動的狀態，生長快，易分離成功。
植物病原真菌的分離有組織分離法和稀釋分離法兩種，在病組織上產生大量孢子的病原真菌以及病原細菌的分離都可用稀釋分離法。

3．1．1 組織分離法 按照以下步驟進行：
（1）培養皿準備：取滅菌培養皿一個，置于濕紗布上，在皿蓋上注明分離日期、材料和分離人姓名。  
（2）培養皿平板制備：用無菌操作法向培養皿中加入25％乳酸1－2滴（減少細菌污染），然后將熔化而冷至45℃左右的馬鈴薯瓊膠培養基一管倒入培養皿中，輕輕搖動使成平面（分離細菌時則不能加乳酸）。  
（3）切取病組織小塊（葉斑病類）：取新鮮病葉，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣切取小塊（每邊長約3―5毫米）病組織數塊。
（4）表面消毒：將病組織小塊放入70％酒精中浸數秒鐘后，按無菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中消毒1―3分鐘，然后放入滅菌水中連續漂洗三次。也可用漂白粉精片（1－2片），研磨后加滅菌水10ml，消毒5―10分鐘。果實、塊莖和枝稈等組織內部的病原菌可用脫脂棉蘸70％酒精涂拭病部表面，通過火焰燒去表面酒精，重復進行2－3次，達到表面消毒。  
（5）用無菌操作法將病組織小塊移至培養基平面上，每培養皿內可放4－5塊。  
（6）翻轉培養皿，放入26－28℃恒溫箱內培養，3―4日后觀察結果。  
（7）用無菌操作法自培養皿中選擇菌落，挑取少許菌絲及孢子，在顯微鏡下觀察。如系玉米小斑病菌孢子，即可用接種針自菌落邊緣挑取小塊菌落移入斜面培養基，在26－28℃恒溫箱內培養，3－4天后，觀察菌落生長情況，如無雜菌生長，即得玉米小斑病菌純菌種，可置于冰箱中保存。如有雜菌生長，需再次分離獲純培養后，方可移入斜面保存。

3．1．2 稀釋分離法
以棉花紅腐病果為材料，按照下列步驟分離：
（1）取滅菌培養皿三個，平放在濕紗布上，分別編號（1 、2、3），并注明日期、分離材料及分離者姓名。  
（2）用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一培養皿中分別注入0．5－1．0ml滅菌水。  
（3）用滅菌接種餌從棉花紅腐病果上刮取病菌孢子，放入培養皿內的水滴中，配成孢子懸浮液。  
（4）用接種餌蘸一餌孢子懸浮液，與第一個培養皿中的滅菌水混合，再從第一個培養皿移三餌孢子懸浮液到第二個培養皿中，混合后再移三餌孢子懸浮液到第三個培養皿中。每次移菌前，接種餌均需在酒精燈火焰上燒過。 ˇ
（5）將三管熔化并冷卻到45℃左右的培養基，分別倒在三個培養皿中，搖動使培養基與稀釋的菌液充分混勻，平置冷卻凝固。  
（6）將培養皿翻轉后放入恒溫箱（26－28℃）中培養，3－4天后觀察菌落生長情況。  
（7）獲純培養后，從菌落邊緣挑取菌絲塊移入斜面培養3-4天后，放入冰箱保存。  
要獲得純凈培養，一般需經3次稀釋分離（重復3次），當培養物高度一致時才能作為純培養的菌種保存。

3．1．3 真菌的培養
植物病原真菌多為好氣性真菌，在有豐富營養的培養基上能很好地生長，但它們對溫度的要求差異較大，絕大多數的真菌可以在20－30℃間正常生長，但少數要在15－20℃間才能正常生長，少數真菌孢子必須在5℃左右的低溫下才能萌發。

3．2 病原細菌的分離與培養
病原細菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進行分離之前，首先應對病材料作細菌學初步診斷，即經過鏡檢確認有噴菌現象以后，才對該病組織作分離（少數病例無噴菌現象）。

3．2．1 稀釋分離法
稀釋分離法是最經典的標準分離法，方法與真菌孢子稀釋分離法基本相同，但要將病組織放在滅菌水中用滅菌玻棒研碎并讓組織碎塊在水中浸泡30－60分鐘（在滅菌培養皿中研碎并浸泡），讓細菌充分釋放到滅菌水中成為細菌懸浮液再進行稀釋分離。
 
3．2．2 劃線分離法
除去上述稀釋分離法以外，較為方便的方法是劃線分離法，步驟如下：
（1）預先把NA培養基倒在培養皿中，凝成平板后，翻轉放在30℃恒溫箱中4－6小時，使表面沒有水滴凝結。  
（2）配制細菌懸浮液。  
（3）在培養皿蓋上寫上分離材料名稱、日期和姓名。  
用滅菌的接種餌蘸取細菌懸浮液在干燥的培養基平板表面按圖17所示方法劃線。劃過第一次線后的接種環應放在火焰上燒過，冷卻后直接在第一次劃線的末端向另一方向劃線，同上，滅菌后再劃第三、第四次線。  
（4）翻轉培養皿，放在26－28℃恒溫箱中培養，2－3天后觀察有無細菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來（C）。  
（5）仔細挑取細菌的單菌落移至試管斜面，同時再用滅菌水把單菌落細菌稀釋成懸浮液作第二次劃線分離。如兩次劃線分離所得菌落形態特征都一致，并與典型菌落特征相符，即表明已獲得純培養，最好要經過連續三次單菌落的分離。確保純化。

3．2．3細菌的培養
病原細菌的培養條件因種類不同而略異。棒桿菌屬細菌的生長適溫較低（20－23℃）；假單胞菌中的青枯菌類則要求在較高的溫度（35℃）下才能良好地發育；軟腐型歐氏桿菌在厭氧條件下生長比好氣條件下生長更快，致病力更強。

3．3植物病毒分離和純化
植物病毒的分離和純化比較特殊，由于病毒是專性寄生物，因此不能離開活的寄主。操作時雖然不需無菌操作，但仍必須實行嚴格的隔離以防止污染和混雜。 ′
以有花葉病癥狀的煙草病葉為材料，進行病毒的“單斑分離”與純化，步驟如下：  
（1）首先用肥皂水洗凈雙手，特別注意刷去指甲內的污染物。  
（2）采摘半片病葉放在消過毒的研缽中，加磷酸緩沖液（0.01M PBS，pH7．2）1ml（5－6滴），研碎。  
（3）在供接種用的心葉煙幼苗和莧色藜幼苗健苗頂部平展葉片上，撒少許金剛砂（600目／英寸2），然后用手指蘸取病汁液輕輕涂抹葉片（摩擦接種），寫好標簽牌，插在盆缽中。  
（4）3分鐘后用自來水將接種葉沖洗干凈，放在溫室中培養。  
（5）2-3天后在接種葉上即出現壞死性枯斑，初為褪綠，后為黃白色。  
（6）剪下單個枯斑，再按上述方法接種健康的心葉煙和莧色藜幼苗，使它再次出現形狀大小、色澤均一致的枯斑，即為已經分離純化的病毒標樣。材料經快速干燥后可置低溫下保存。  
（7）將此枯斑病葉分別接種到黃瓜或普通煙草上，又可得到系統的花葉癥狀。不同的病毒接種在不同的寄主植物上會變現不同的癥狀。選用這些特定寄主植物作為鑒別寄主，進行病毒和病毒病害的診斷，可做出初步鑒定。將病組織汁液接種在枯斑寄主上，根據枯斑的特征，還可進一步區分病毒的種類，并作為病毒定量的一種簡易方法。

3．4 植物病原線蟲的分離
大部分植物寄生線蟲只為害根部，有些還是根內寄生的，少數可為害地上莖、葉、花果。從有病植物材料中和土壤中分離線蟲的方法很多，它們各有優缺點，常用的方法有漏斗分離法、淺盤分離法、漂浮分離法等。

3．4．1 貝曼（Baermann）漏斗分離法
操作簡單、方便，適于分離植物材料和土壤中較為活躍的線蟲。一般是選用一只口徑為10－15cm塑料漏斗，下接一段長約5－10crn帶有彈簧夾的乳膠管，漏斗放在木架或鐵環上，漏斗內盛滿清水，病植物材料或土樣用雙層紗布包扎好，慢慢浸入清水中，浸泡24小時后樣品中線蟲因喜水而從材料中游到水中，并因自身重量逐漸沉落到漏斗底部的橡皮管中，慢慢放出5ml管中水祥于離心管中，在1500轉／分的離心機中離心3分鐘，傾去上層水液，將底部沉淀物連同線蟲一起倒在表面皿或計數皿中，在解剖鏡下計數，然后將線蟲挑至裝有固定液的小玻管中備用。樣品材料也可用一網篩擱在漏斗口上，使水面能淹沒材料，線蟲也可以游離出來并沉降到底部。

3．4．2 淺盤分離法 用兩只不銹鋼淺套放在一起，上面一只稱篩盤，它的底部是篩網（10目／英寸2），下面一只淺盤略大些是盛水盤（底盤）。
將特制的線蟲濾紙放在篩盤中用水淋濕，上面再放一層餐巾紙，供分離的土樣或材料放在餐巾紙上，在兩盤之間隙縫中加水浸沒材料，在室溫（20℃以上）下保持8天，材料中的線蟲大都能穿過濾紙而進入托盤水中，收集淺盤中的水樣通過二個小篩子（上層為25目粗篩，下層為400目細篩）。線蟲大多集中在下層篩上，可用小水流沖洗到計數皿中。  
淺盤法比漏斗法好，它可以分離到較多的活蟲，而且泥沙等雜物較少。

3．4．3 胞囊漂浮器分離法（Fenwick－Oostenbrink改良漂浮法）
對于沒有活動能力的線蟲胞囊可采用Fenwick漂浮筒漂浮的方法分離，筒內先盛滿清水，把10.0g風干土樣放在頂篩中。用強水流沖洗土樣，使全部淋入筒內，再用細水流從頂篩加入，使土粒等雜物沉入筒底，胞囊和草渣等則逐漸漂浮起來沿倚口傾斜的環槽流到承接篩中（100目）,先把篩中胞囊等沈入燒杯中，再倒入鋪有濾紙的漏斗中，收集濾紙上的胞褒。  
在解剖鏡或擴大鏡下，學習用鑷子、毛針、竹針、毛筆等工具從水樣或濾紙上挑取線蟲。

3.5 拌種法和浸種法 種子傳染的病害可采用這兩種接種方法。拌種法是將病菌的懸浮液或孢子粉拌和在植物種子上，然后播種誘發病害。小麥腥黑穗病可采用此法接種。浸種法是用孢子或細菌懸浮液浸種后播種，大麥堅黑穗病、棉花炭疽病和菜豆疫病可用此法接種。

3.6 土壤接種法 由糞肥、土壤傳染的病害可以采用拌土接種法。土壤接種法是將人工培養的病菌或將帶菌的植物粉碎，在播種前或播種時施于土壤中，然后播種。也可先開溝，溝底撒－層病殘體或菌液，將種子播在病殘體上，再蓋土。  
有的病原物能在土壤中長期存活（土壤習居菌），把帶菌土攘或帶有線蟲接種體的土樣接種到無菌（蟲）土中，再栽種植物，就可以使植物感染，如棉花枯黃萎病、小麥土傳花葉病毒和一些線蟲病等。對于青枯菌可以采用土壤灌根的方法。

3．7噴霧法和噴撒法 這兩種方法適用于氣流和雨水傳染的病害，大部分細菌病害和真菌葉部病都可采用噴霧接種，如水稻細菌性條斑病、玉米大斑病、小斑病。將接種用的病菌配成一定濃度的懸浮液，用噴霧器噴灑在待接種的植物體上，在一定的溫度下保濕24小時，誘發病害。

3．8傷口接種 除了植物病毒接種時常用的摩擦接種屬傷口接種之外，植物病原細菌、病原真菌也常用傷口接種法。許多由傷口侵入，導致果實、塊根、塊莖等腐爛的病害均可采用。先將接種用的瓜果等洗凈，用70％酒精表面消毒，再用滅菌的接種針或滅菌的小刀刺傷或切傷接種植物，滴上病菌懸浮液或塞入菌絲塊，用濕脫脂棉覆蓋接種處保濕。  
水稻白葉枯病的傷口接種常用剪葉接種和針刺接種法。先通過火焰或用75％酒精消毒解剖剪，將剪刀在白葉枯病菌懸浮液中浸一下，使剪刀的刃口蘸滿菌液，再將要接種的稻葉葉尖剪去。接種處不必保濕，定期觀察病情。細菌懸浮液的濃度為108cfu／ml。

3．9 介體接種
3．9．1 菟絲子接種 在溫室中研究病毒、菌原體等病害廣為采用的一種接種方法，先讓菟絲子侵染病株，待建立寄生關系或進一步伸長以后，再讓病株上的菟絲子侵染健株，使病害通過菟絲子接種傳播到健康植株上。

3．9．2 蚜蟲及其他介體昆蟲接種 詳見植物病毒的傳染方法。
所有的接種實驗都應設有對照，即用清水代替病菌，用同樣的方法接種，觀察發病與否。  
分別用土壤灌根法接種番茄青枯菌、用噴霧接種法接種水稻稻瘟病菌、用剪葉接種的方法接種水稻白葉枯病菌，注意針對不同病害接種后培養的條件，觀察不同病害癥狀出現的過程。