如何使用慢病毒感染細(xì)胞？

使用慢病毒感染細(xì)胞的操作流程取決于細(xì)胞種類，因此首先要了解細(xì)胞的來源和背景。通常來講首先要根據(jù)MOI和需要感染細(xì)胞量計(jì)算所需要的病毒量，然后將所需病毒液加入培養(yǎng)體系后4小時(shí)左右即可換成完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

慢病毒染后為什么細(xì)胞中出現(xiàn)大量黑點(diǎn)，并影響細(xì)胞生長？

在排除細(xì)菌及真菌污染后，細(xì)胞中的黑點(diǎn)通常為細(xì)胞碎片，導(dǎo)致細(xì)胞破碎的原因有很多，但在慢病毒感染后，細(xì)胞破碎通常有兩個(gè)原因：

a. 慢病毒使用量過多，或細(xì)胞數(shù)量過少；

b. 支原體污染。由于輕度的支原體污染并不影響細(xì)胞的生長和增殖，故支原體污染被許多實(shí)驗(yàn)室所忽略。

但支原體易在病毒感染細(xì)胞后爆發(fā)，故會(huì)出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片。建議在使用病毒制品時(shí)，應(yīng)首先排除細(xì)胞、培養(yǎng)物及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染，以節(jié)約時(shí)間。

病毒感染目的細(xì)胞感染不上或效率低？

和以下幾個(gè)因素有關(guān)：

1、病毒活性：解凍病毒一定要在冰上進(jìn)行，盡量避免反復(fù)凍融， -80 ℃ 保存半年以上需要重新測滴度；

2、目的細(xì)胞：最好預(yù)實(shí)驗(yàn)測試過，看病毒載體是否合適感染目的細(xì)胞。一些難感染的細(xì)胞，如懸浮細(xì)胞，原代細(xì)胞等，或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)適合用腺病毒或AAV；

3、MOI值：一般來說MOI都是要用梯度法來摸索的，同的病毒感染不同的細(xì)胞的MOI值也不一樣，如果感染細(xì)胞所用的病毒量不夠的話，感染效率肯定不好；需要確認(rèn)MOI計(jì)算及細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

4、感染時(shí)間：慢病毒一般在感染后24h換液，感染后換液太早會(huì)導(dǎo)致感染效率下降；感染后換液太晚，則對細(xì)胞的損傷太大，效率也不高。感染后48h開始觀察熒光，由于慢病毒的表達(dá)時(shí)間較長，有的72h，120h才能看到熒光。

5、其他：是否加入 polybrene 以及熒光顯微鏡的使用等因素有關(guān)

要曝光很長時(shí)間才能觀察到熒光？

要曝光很長時(shí)間才能觀察到的熒光，說明熒光比較弱，可能的原因有：

1、顯微鏡汞燈使用時(shí)間長，這個(gè)可以通過對照排除，看是否有比較亮的對照，或者如果有其他比較亮的樣品，證明不是汞燈的問題。

2、PH值低，看培養(yǎng)基是否發(fā)黃導(dǎo)致綠色熒光猝滅。

3、目的病毒光不亮，插入目的基因后的病毒熒光強(qiáng)度與對照相比弱一些，這個(gè)屬于正常現(xiàn)象，增加曝光時(shí)間，看感染上的陽性細(xì)胞比例如何，看看目的和對照的熒光的差異，如果感染比例尚可，差異不是很大，用Puromycin篩選有大量細(xì)胞存活，則病毒也可以使用。