顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯**況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。

　　OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

　　TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達ding峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。

　　elisa實驗之比色

　　比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。

　　比色結果的表達以往通用光密度（oplicaldensity，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

　　ELISA顯色淡的原因如下：

　　原因一：試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高。

　　解決方案：盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫。

　　原因二：試劑盒未充分平衡。

　　解決方案：試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。

　　原因三：培養箱溫度不足37℃。

　　解決方案：注意培養箱溫度，放入反應板后盡量減少開啟次數以免影響溫度恒定，非隔水式培養箱尤其應注意。

　　原因四：保溫時間不足。

　　解決方案：校正定時鐘準確定時。

　　原因五：洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數增加。

　　解決方案：按說明書要求保留洗滌時間，準確記住洗滌次數。

　　原因六：移液器吸液量不足，吸嘴內壁掛水太多或內壁不清潔。

　　解決方案：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密，吸嘴內壁要清潔，一次性使用。

　　原因七：蒸餾水水質有問題。

　　解決方案：使用新鮮合格的蒸餾。

　　原因八：底物作用時間不足。

　　解決方案：準確定時。

　　顯色一定要控制時間，根據試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。