DHFR二氫葉酸還原酶抗體是一類可以特異性結(jié)合DHFR二氫葉酸還原酶的多克隆抗體，主要用于檢測DHFR二氫葉酸還原酶的免疫組化、ELISA等實驗。DHFR二氫葉酸還原酶是催化葉酸還原成四氫葉酸(H4FA)的酶。H4FA形成過程分兩步進(jìn)行，由同一個酶催化，H4FA作為一碳單位載體，為嘌呤核苷酸從頭合成和胸嘧啶核苷酸合成等提供一碳單位。氨基蝶呤和氨甲蝶呤的結(jié)構(gòu)類似葉酸，與二氫葉酸還原酶結(jié)合的平衡常數(shù)為10-10mol/L，比葉酸與該酶的結(jié)合能力強1000倍，故是一種極強的競爭性抑制劑。

腫瘤細(xì)胞經(jīng)用氨甲蝶呤處理，增殖停止，最終細(xì)胞死亡，正是因為核苷酸合成受阻，進(jìn)而阻斷核酸合成的結(jié)果。DHFR二氫葉酸還原酶存在于微生物和肝臟中的二氫葉酸還原酶曾有所細(xì)致的研究。分子量約為2萬。似乎也有催化葉酸使之還原成二氫葉酸的作用，所以可將葉酸成為該酶輔酶的活性型的四氫葉酸。在核酸合成旺盛的白血病患者的白血球中含量很多，而其抗癌藥氨[基]蝶呤（4-氨基蝶酰[基]谷氨酸）等的作用機(jī)理，可能是因為在低濃度（10-8M）下可抑制此酶而抑制核酸的合成。

遠(yuǎn)慕生物二氫葉酸又稱二氫蝶酰谷氨酸。針狀結(jié)晶(含兩分子結(jié)晶水)，貯存漸變色；室溫下，pH值6，過夜50%分解；pH值6以下不穩(wěn)定。人體能直接利用食物中的葉酸(folic acid)，并根據(jù)需要在體內(nèi)可還原為相應(yīng)的二氫葉酸和四氫葉酸。某些細(xì)菌不能直接利用外源葉酸，只能在二氫葉酸合成酶的催化下合成二氫葉酸。在實驗室中二氫葉酸可通過葉酸分子之第7,8位上加氫而得。二氫葉酸與氨基酸代謝、嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成相關(guān)聯(lián)，作為四氫葉酸的前體，在人體內(nèi)是通過含有NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的二氫葉酸還原酶催化而成四氫葉酸，后者在一碳單位轉(zhuǎn)移過程中起輔酶作用。還可作為二氫葉酸還原酶的測定試劑。

應(yīng)用

用于葉酸受體及二氫葉酸還原酶在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR多藥耐藥中的作用研究

以耐阿霉素人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR為實驗對象,驗證FOLRa受體基因及其下游基因二氫葉酸還原酶的表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥中的作用。

方法:1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和計數(shù)了解細(xì)胞生長情況;2.采用MTT法檢測ADR細(xì)胞毒性作用;3.RT-PCR檢測細(xì)胞葉酸受體、二氫葉酸還原酶mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;4.MTT法檢測甲氧芐啶對MCF-7/ADR細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用;5.免疫細(xì)胞化學(xué)測定細(xì)胞P-gp和FOLRa的表達(dá)水平。

結(jié)果:1.MCF-7/S細(xì)胞增殖速度快于MCF-7/ADR細(xì)胞;

2.MCF-7/ADR細(xì)胞對ADR的耐藥倍數(shù)約為22.5倍;

3.MCF-7/S細(xì)胞FOLRamRNA轉(zhuǎn)錄水平較MCF-7/ADR細(xì)胞高,而MCF-7/ADR細(xì)胞二氫葉酸還原酶mRNA轉(zhuǎn)錄水平較MCF-7/S細(xì)胞高;

4.24μmol·L-1及以下濃度的甲氧芐啶對MCF-7/ADR細(xì)胞有輕度抑制作用（抑制率＜20%）,而對MCF-7/ADR細(xì)胞的多藥耐藥無逆轉(zhuǎn)作用;

5.免疫細(xì)胞化學(xué)顯示MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp表達(dá)水平較MCF-7/S細(xì)胞高,而MCF-7/S細(xì)胞FOLRa表達(dá)量高于MCF-7/ADR細(xì)胞。

結(jié)論:1.MCF-7/ADR細(xì)胞的FOLRa的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)、二氫葉酸還原酶mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高、細(xì)胞P-gp表達(dá)增高,說明MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥可能與細(xì)胞FOLRa的mRNA轉(zhuǎn)錄下調(diào)、二氫葉酸還原酶mRNA轉(zhuǎn)錄升高導(dǎo)致P-gp增加有關(guān);

2.甲氧芐啶對MCF-7/ADR細(xì)胞多藥耐藥無逆轉(zhuǎn)作用。