一、安瓿瓶的打開方法

常見的用于保存菌種凍干粉的安瓿瓶有單層和雙層兩種，如下圖1所示。

圖1 兩種用于保存菌種凍干粉的安瓿瓶

圖2 單層安瓿瓶的打開方式

圖3 雙層安瓿瓶的打開方式

若雙層安瓿瓶底部的干燥劑（藍色硅膠珠）呈現無色或粉紅色，則表明發生了泄漏，安瓿瓶內已不是真空狀態，此時管內的菌種可能已經無法復蘇。

如果不是立即對菌種進行復蘇處理，則需要將安瓿瓶存放在2-8℃冰箱中。

二、菌種復蘇實驗流程

1、厭氧條件準備

根據菌株供應商提供的培養信息準備相應的固體和液體培養基，如果是厭氧菌株，準備厭氧倉條件。

2、菌株復蘇

打開安瓿瓶，用0.5-1mL液體培養基重懸管內的菌體。若菌種為真菌，則建議將菌懸液轉移至5-6mL無菌水中室溫孵育數小時，孵育時間越長，菌株的活性越高。

若是進行液體培養，則將菌懸液全部取出，接種至5-6mL液體培養基中。若為固體平板培養，則需要將菌懸液按200μL/板的量接種至固體培養基平板上。

在合適的條件下進行培養，通常情況下會在2-5天內長菌，少數菌株會需要更長的培養時間。

3、菌種復蘇后，對菌種進行保存，采用一代測序的方法進行菌種鑒定，來判斷復蘇出來的菌種是否符合預期。

4、根據老師要求，對復蘇成功的菌株，進行擴大培養。

5、菌株擴培后，再次進行一代測序，來判斷擴培菌株是否符合預期。

6、采用qPCR的方法，對擴培的菌株進行拷貝數的定量，根據rrnDB中菌株的拷貝數，進行菌株個數的轉化。如果菌種水平沒有拷貝數信息，那么根據更高一個級別進行轉化。并稀釋或濃縮到老師需要的菌株濃度。

7、根據需求對菌株進行分裝，如果是厭氧菌株，則在厭氧倉中進行，并獨立包裝，加上吸氧劑抽真空保存。方便老師后繼使用方便。

8、活菌的運輸：如果菌株中加了凍存試劑，必須采用干冰運輸，老師收到菌株后放在-80℃保存。如果老師指定要求是新鮮菌液，那么采用冰袋運輸，老師收到菌株后放在4℃冰箱保存，并盡快使用掉，不宜在4℃冰箱中長期保存。

三、注意事項

1、針對厭氧菌株，以上操作都必須在無氧環境下進行。若在有氧環境下復蘇厭氧菌，會導致菌株的活性會大幅下降，甚至復蘇失敗。

2、必須在符合相應的生物安全等級的實驗室中，由接受過專業訓練的人員進行以上所有操作。

3、操作過程中，需要全程做好防護措施。實驗過程中產生的廢棄物必須先滅菌，然后才能丟棄。

4、致病性的菌株公司不提供相應的服務。