Edman降解法

實驗方法原理
主要有質譜法，利用蛋白質測序儀進行測序以及利用蛋白質對應DNA或mRNA進行間接測序。

傳統的蛋白質測序實驗一般包括以下步驟：
1.肽鏈的拆開和分離；
2.測定蛋白質分子中多肽鏈的數目；
3.二硫鍵的斷裂；
4.測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；
5.N端、C端的測定；
6.多肽鏈斷裂；
7.測定每個肽段的氨基酸順序；
8.確定肽段在多肽鏈中的次序；
9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。

實驗材料
蛋白質樣品
試劑、試劑盒
尿素 鹽酸胍 巰基乙醇
儀器、耗材
蛋白質測序儀

實驗步驟
1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分，一般用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理蛋白質，分開蛋白質的多肽鏈。
2.測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。
3.二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用碘乙酸（烷基化試劑）保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。拆開后的肽鏈可用層析或電泳進行分離。
4.測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比。可用于促進測序過程中的錯誤的發現或區分模糊結果。對某些氨基酸頻率的了解也可用于選擇用于蛋白質消化的蛋白酶。還可以確定低水平的非標準氨基酸（例如正亮氨酸）錯誤摻入蛋白質中。

（1）水解。通過將蛋白質樣品在6mol/L 鹽酸中加熱至100-110℃24小時或更長時間來進行水解。具有許多龐大疏水基團的蛋白質可能需要更長的加熱時間。一些氨基酸（絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，色氨酸，谷氨酰胺和半胱氨酸）可能被降解。為了解決這個問題，Biochemistry Online建議將不同時間的樣品加熱，分析每種產生的溶液，并推斷回零水解時間。拉斯特爾建議使用各種試劑來預防或減少降解，例如硫醇試劑或苯酚，以保護色氨酸和酪氨酸免受氯的侵襲，并預氧化半胱氨酸。他還建議測量釋放的氨的量以確定酰胺水解的程度。

（2）分離和定量。可以通過離子交換色譜法分離氨基酸，然后通過衍生化進行檢測。另一種方法是將氨基酸衍生化，然后通過反相HPLC分離。

使用磺化聚苯乙烯作為基質進行離子交換色譜分析。在酸溶液中加入氨基酸并使穩定增加pH的緩沖液通過交換柱。當pH達到它們各自的等電點時，氨基酸被洗脫。一旦氨基酸被分離，通過添加將形成有色衍生物的試劑來確定它們各自的量。如果氨基酸的量超過10nmol，則可以用茚三酮，它與脯氨酸反應時呈黃色，與其他氨基酸發生鮮艷的紫色。氨基酸的濃度與所得溶液的吸光度成比例。非常少量或者低于10pmol的氨基酸，可以使用諸如鄰苯二甲醛（OPA）或熒光胺的試劑形成熒光衍生物。

柱前衍生化可以使用Edman試劑產生的衍生物可通過UV光檢測。使用產生熒光衍生物的試劑可以獲得更高的靈敏度。將衍生化的氨基酸進行反相色譜，通常使用C8或C18 二氧化硅柱和優化的洗脫梯度。使用UV或熒光檢測器檢測洗脫的氨基酸，并將峰面積與衍生化標準品的峰面積進行比較，以量化樣品中的每種氨基酸。

5.分析多肽鏈的N-末端和C-末端。
（1）N末端分析法：（2，4-二硝基氟苯（DNFB）法；異硫氰酸苯酯（PITC）法；丹黃酰氯（DNS）法；氨肽酶法）；
（2）C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。

6.多肽鏈斷裂成多個肽段。
分解肽鏈可通過內肽酶如胰蛋白酶或胃蛋白酶或通過化學試劑如溴化氰進行。不同的酶產生不同的切割模式，并且片段之間的重疊可用于構建整體序列。

7.測定每個肽段的氨基酸順序
將待測序的肽段吸附在固體表面上（一種常見的基材是涂有聚苯乙烯（一種陽離子聚合物）的玻璃纖維），將異硫氰酸苯酯（PITC）與12％三甲胺的溫和堿性緩沖溶液一起加入到吸附的肽中，與N-末端氨基酸的胺基反應。然后可以通過加入無水酸選擇性地分離末端氨基酸。然后衍生物異構化得到取代的苯基乙內酰脲，其可以洗掉并通過色譜法鑒定，并且可以重復該循環。每個步驟的效率為約98％，允許可靠地確定約50個氨基酸。

序列測定也可以直接用蛋白質序列分析儀。將蛋白質或肽的樣品固定在蛋白質測序儀的反應容器中并進行Edman降解。每個循環從蛋白質或肽的N-末端釋放并衍生出一個氨基酸，然后通過HPLC鑒定釋放的氨基酸衍生物。對整個多肽重復進行測序過程，直到建立整個可測量序列或預定數量的循環。

8.確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
根據已知氨基酸順序選擇合適的專一性蛋白質水解酶（一般采用胃蛋白酶）在不打開二硫鍵的情況下部分水解蛋白質，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。         

注意事項
1.樣品純度不能太低，經驗認為純度大于90%的蛋白才適用于測序反應。
2.N端封閉或糖基化的蛋白質難以進行Edman反應，無法測序。

其他的蛋白質測序方法還有：
1.可通過Edman降解確定的短蛋白質序列（10至15個殘基）被翻譯成DNA序列，用作探針或引物以分離相應基因或互補DNA的分子克隆。然后測定克隆DNA的序列并用于推斷蛋白質的完整氨基酸序列。
2.蛋白質從頭測序（De novo sequencing），又叫全新蛋白測序。這項技術是根據肽段與惰性氣體相碰撞產生的一系列的有規律的片段離子之間的質量差來推斷氨基酸序列。我們可以根據肽鍵斷裂處的y離子和b離子來推測氨基酸序列，以及翻譯后修飾。De novo sequencing有一項突出的優勢，是傳統質譜測序不能達到的，那就是不依賴任何蛋白質數據庫，對未知蛋白質從頭測序。