1、樣本準備過程中防止蛋白質降解和保留翻譯后修飾

樣本準備過程中，細胞會釋放蛋白酶和/或去磷酸化酶，為了減少這些酶的活性，處理樣本的過程應在冰上進行，并預先冷卻所有緩沖液，并且建議用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液。

2、磷酸化特異性抗體的選擇

選擇磷酸化特異性抗體時，選擇所要檢測位點的磷酸化抗體至關重要。磷酸化都會使蛋白質的分子量增加80Da，檢查抗體是否檢測到磷酸化靶蛋白的分子量正確的條帶也很重要。

3、誘導磷酸化

課題設計可能需要在收獲前刺激細胞，以確保蛋白質被磷酸化。 例如，在特定細胞信號傳導途徑激活后，靶蛋白可能在目的位點被磷酸化。

4、濃縮樣品

當觀察相對罕見的磷酸化事件時，可以使用最小體積的裂解緩沖液來裂解樣品達到濃縮的目的。 如果目的蛋白質的亞細胞位置已知，例如，如果您的蛋白質位于細胞核中，您可以先進行細胞分級分離，僅將細胞核裂解組份進行蛋白質印跡實驗。 您也可以考慮使用針對您感興趣的蛋白質的抗體進行免疫沉淀（IP），而不管磷酸化狀態如何。

5、優化封閉液

為您的抗體選擇最佳的封閉試劑。 對于磷酸化分析，可以從含酪蛋白或BSA的TBS緩沖液開始。 使用牛奶會導致更高的背景，因為它含有的蛋白質可能會干擾磷酸化蛋白質的目標檢測。 其他封閉試劑如雞卵清蛋白，魚明膠和市售合成封閉試劑也可提供可行的替代方案。 在計劃磷酸化蛋白質印跡實驗時，重要的是要記住，沒有一種適合所有樣品的封閉液。

6、轉印膜的選擇

可以將蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上。 PVDF膜具有高機械強度，需要膜剝離和再雜交時使用，通常情況下，當您使用總蛋白作為磷酸化靶標的上樣對照時。 由于PVDF具有比硝酸纖維素更高的結合能力，因此優選用于低豐度的磷酸化靶標。 然而，PVDF的結合能力增強也意味著與硝酸纖維素相比，您有可能看到更高水平的非特異性結合和背景。 如果您正在進行全蛋白內參歸一化或使用熒光二抗，建議使用低熒光背景PVDF（LF PVDF）膜。

7、洗滌

用于執行洗滌步驟的緩沖液的類型也可以對信號與背景產生影響。 通常，與基于磷酸鹽緩沖液（PBS）相比，使用基于tris緩沖液（TBS）通常可以產生更強的信號。 注意，PBS中磷酸根離子的存在可能干擾來自磷酸化靶蛋白的信號。 在洗滌緩沖液中加入Tween-20等洗滌劑也有助于去除非特異性結合在膜上的物質。

8、總蛋白質的檢測

使用檢測目標蛋白總水平的抗體，可以確定相對于總目標蛋白的磷酸化比例。這使您可以比較不同處理的影響，并提供內參。

9、總蛋白內參歸一化

總蛋白內參歸一化是一種用于量化目標蛋白質豐度的技術。這涉及將條帶灰度值按照樣品中總蛋白質進行標準化。