1、蛋白胨稀釋液的制備:

將1g蛋白胨(細菌蛋白胨除外)溶于1000mL去離子水中，用鹽酸調節pH至7.0，滅菌溫度為121℃。時長15分鐘。

2、微量元素溶液制備:

微量元素水溶液營養成分的組成如表1所示
 

微量元素	濃度
氯化鈉	10mg/mL
七水硫酸亞鐵	18mg/mL
一水硫酸錳	16mg/mL
七水硫酸鋅	1.6mg/mL
五水硫酸銅	1.6mg/mL
七水硫酸鈷	1.6mg/mL

3、液化GYE瓊脂培養基的制備:

營養成分的組成如表2所示
 

試劑	數量
酵母提取物粉末	5.0g
蛋白胨	5.0g
葡萄糖	5.0g
磷酸氫二鉀(K2HP04)	0. 5g
磷酸二氫鉀(KH2P04)	0. 5g
硫酸鎂	0.3g
微量元素	1.0mL
水	1000.0mL

使用乳酸溶液調節上述營養成分混合液pH到6.3。將混合液轉移到大錐形瓶中，向錐形瓶中加入15.0g瓊脂。使用鋁箔包裹錐形瓶，將其放置于加熱板上進行加熱，并攪摔，直到瓊脂完全溶解。隨后在高壓滅菌鍋中在121℃下進行至少15分鐘滅菌。待高壓滅菌鍋可以安全打開時，將錐形瓶放置于50℃的水浴中。

4、樣品準備

4.1 食品取樣

稱取25g樣品，置于無菌均質袋中，加225mL滅菌蛋白胨水，拍擊式均質器均質至完全溶解于蛋白胨水，混勻。

注:若樣品不能完全溶于蛋白胨水，需要將蛋白胨水預熱至50℃再加入樣品，或加入樣品后將混合懸浮液置于50℃預熱5min,直至樣品完全溶解。

4.2 檢查混合懸浮液pH值。若pH小于7.0，用氫氧化鈉(5N)溶液調節pH至8.5±0.2;若pH大于8.7，用鹽酸溶液(5N)調節pH至8.5±0.2。

4.3 樣品移取20-30mL均質懸浮液于50ml離心管中于75℃水浴30min,立即冷卻至45℃以下，然后移液。

4.4 移取1.0ml該液于9.0mL滅菌蛋白胨水的試管中，渦旋徹底混勻(10-2稀釋管即得)。

4.5 根據要求重復操作。所做稀釋度及平板培養所用稀釋度應隨預期孢子數變化而變化。

注1:將每個稀釋度溶液混勻，然后移液;

注2:步驟4.3:將離心管置于水浴后立即開啟計時器。

5、平板培養

5.1 液化GYE瓊脂培養基，然后置于水浴中冷卻至50℃以下(該培養基容易凝固，要置于50℃左右的水浴鍋內) ;每個稀釋度準備兩個無菌培養皿。分別從最后兩個稀釋管溶液中加1.0mL于相應編號的培養皿中，然后將15至20mL的熔融培養基倒至各個培養皿，徹底混勻。待固化時，將平板翻轉，40℃+2℃培養48小時，同時準備一個只包含瓊脂培養基及一個只含有1.0mL蛋白胨稀釋液和瓊脂培養基作為陰性對照。

6、平板計數

菌落數在30至300之間的平板計數最為理想。平板計數只記錄滿足以下條件的菌落:瓊脂表面的菌落需要直徑為1mm到5mm;白色到奶色，凸面，具有完整的邊緣和光滑的表面。嵌在瓊脂培養基中的菌落需要直徑為0. 5mm-1mm在瓊脂中具有奶色的點狀體。

6.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g(mL)樣品中菌落總數結果。

6.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按公式(1)計算:

N= ∑C/ (n1+0.1n2)d........................ (1)

式中:

N-樣品中菌落數:

∑C - 平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和:

n1 - 第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;

n2 - 第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;

d - 稀釋因子(第一稀釋度)。