微生物的檢驗工作對環境有特殊的要求。潔凈環境是微生物檢驗工作中必須的環境基礎。微生物檢驗工作所處的無菌室必須注意定期消毒。避免檢測物受到污染。今天咱們就聊一聊微生物檢驗中的無菌操作技術。

無菌室的工作要盡可能減少交流。不允許在無菌室內談笑。要盡可能減少在無菌室內走動。沉降菌技術必須按照規定的時間進行使用。工作人員進入無菌室工作之前必須做好前期準備工作。

要按照規定穿戴經過特殊處理的服裝、并對身體做好清潔、避免對檢測品造成污染。在檢測樣品的提取過程中，工作人員要盡可能遠離檢測物品。避免檢測物品受到細菌污染。檢測樣品提取之后要進行科學的保存，避免受到污染。提取過程要盡可能加快速度，不能將檢測樣品在空氣中閑置太長的時間避免空氣中的細菌對檢測樣品造成污染。

檢測樣品的提取過程必須嚴格遵守無菌操作的程序。打開儲存樣品的時候，要使用濃度為75%的酒精對存在檢測樣品的器皿瓶口進行消毒，要使用酒精棉球作為消毒的重要工具。器皿的瓶口要進行兩次以上的酒精消毒，提取工作完成之后要科學的安放檢測樣品，并且隨時檢查儲存檢測樣品的空間，避免檢測樣品受到污染。
無菌操作的重要性

所謂無菌，指的是不存在保證生命活動的營養細胞的狀態。而無菌操作則是采用無菌的器械進行操作，防止微生物進入無菌范圍的技術。在微生物檢驗中，無菌操作是重要的理念，只有采用無菌操作技術，保持樣本在檢驗過程中不受到二次污染，才能保證檢驗結準確的反映出樣本的衛生狀況。

在檢驗的各個環節，都有可能有微生物的進入，因此無菌操作技術應貫穿整個檢驗過程，如果有一個環節沒有采用無菌操作，那么其他環節的無菌操作也將沒有任何意義。

無菌操作的具體應用

1、取樣

微生物檢驗首先是從樣本中無菌稱取要求檢驗的質量，取樣過程中使用的天平要經過消毒，檢驗用品如剪刀、藥匙要經過170℃/2h 干熱滅菌。取樣過程嚴格按照無菌操作進行，才能保證樣品的原始狀態。

前處理

根據國標要求，取樣后要對樣品進行前處理。一般而言，稱取 25g/ml 樣品于盛有225ml無菌稀釋液的無菌均質袋中均質，制備成1:10樣品勻液進行檢驗。對于計數樣品要，制備10倍系列稀釋樣品勻液，操作方法參見GB4789.2-2016。整個過程必須嚴格按照無菌操作進行。

3、純種分離

在微生物檢查過程中，為了更加準確的確定微生物群體，需要將疑似的目標菌從混雜的樣品中分離出來，進而得到純培養物。

通常情況下，需要結合不同微生物的具體特性，針對性的選擇培養基與培養條件，促進目標微生物的繁殖。或者通過使用某種抑制素，抑制除目標菌以外的雜菌生長，進而將其他雜菌淘汰。接著將培養物接種在固體培養基上形成目標菌的單菌落。這種單菌落還需要進行一定的純化與鑒定，才能保障分離的菌株為純菌株。

在整個分離純化過程中，通常需要用接種環把微生物的純培養物從一個器皿轉接到另一個器皿中培養。在這一過程中，如果不能嚴格按照無菌操作進行，很難保證檢驗結果的準確性。同時，實驗人員應加強自身實驗水平與操作能力，確保無菌操作技術熟練、準確。

4、革蘭氏染色

革蘭氏染色技術是微生物確認鑒定中重要的方法，將疑似的目標菌經過純化分離后染色，在光學顯微鏡下觀察微生物形態，能初步鑒定微生物是否是所檢驗的目標菌。革蘭氏染色的操作步驟：涂片—初染—媒染—脫色—復染，整個過程中最重要的是涂片，涂片過程中必須嚴格無菌操作，避免雜菌混入，影響鏡檢結果。

5、空白對照

根據《GB4789.2-2016 安全國家標準微生物學檢驗菌落總數測定》，將營養瓊脂培養基傾入加有1mL空白稀釋液滅菌培養皿內作空白對照。空白對照的結果可以說明三個問題：

① 檢驗過程中所使用的檢驗用品滅菌是否徹底；

② 無菌室的空氣條件是否達到標準；

③ 操作人員的無菌操作技術是否規范。

通過空白對照的結果可直接檢驗出實驗器皿、實驗條件以及實驗人員的操作是否達到無菌操作的要求。只有空白對照結果符合要求，實驗結果才是有效的。

操作人員在進行微生物檢驗時，一定要樹立無菌操作觀念，規范無菌操作程序，才能保證檢驗流程順利完成。同時，操作人員要根據實際需要，合理運用無菌操作技術，避免在微生物檢驗中，引入雜菌，影響檢驗結果的真實性、準確性。