在應用MALDI-TOF MS時，通常將微生物樣本與一種飽和的低分子量無機化合物溶液（稱為基質）進行混合加在靶板上，待干后樣本與基質共結晶后形成了以基質包裹構架的樣本固體沉淀。樣本基質結晶體經激光輻射，基質從激光中吸收能量使樣品吸附，基質與樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，離子在加速電場下獲得相同的動能，經高壓加速、聚焦后進入飛行時間檢測器。 根據離子飛行時間的不同進行分析得出離子質荷比（m/z）和離子峰值，形成質量圖譜。不同的微生物由于蛋白分子組成有差異而形成具有特異性的圖譜，通過軟件對數據庫的比對進行微生物種或菌株的區分和鑒定。

質譜鑒定方法十分迅速，可以在數分鐘內完成微生物鑒定，有研究顯示MALDI-TOF MS與傳統方法比較降低了實驗室成本和出報告的時間，與傳統方法所需的數小時相比是一個質的飛躍。此外，質譜操作簡便，通量高，可以同時鑒定多個樣本。通常質譜數據庫是作為儀器的組成部分，由各自公司開發和維護，這一點有別于公共開放數據庫。

質譜儀數據庫的可擴展性對于進一步的鑒定分析非常重要，尤其是菌種間的區分和流行病學研究等。由于不同的平臺都是在各自的系統中建立自身的數據庫并且發展自身的軟件、算法和評分標準，因此不同的質譜系統給出的數字信息不具備可比性。不同的質譜系統的比較要通過對微生物鑒定最終結果的準確程度來實現。