“單細(xì)胞測序”可以說是這幾年的一個熱門詞匯，越來越多的研究者在自己的研究中用到這項技術(shù)，大家都知道目前單細(xì)胞測序不管是哪個平臺，基本還是需要新鮮的活體組織樣本，這對于很多研究者來說是難以做到的，雖然目前也有單細(xì)胞核測序技術(shù)來解決新鮮組織難以獲取，或者是一些特殊組織樣本難以用活細(xì)胞上機的困境，但是很多老師還是擔(dān)心：冷凍樣本會不會不適合單細(xì)胞測序呢？冷凍樣本獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量會不會不如新鮮樣本呢？ 真相來了，最新的文章研究表明：人類癌癥樣本的冷凍保存可保留腫瘤異質(zhì)性，用于單細(xì)胞多組學(xué)分析。

高通量單細(xì)胞RNA測序（scRNA-Seq）已經(jīng)成為探索復(fù)雜人類癌癥中細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具。使用新鮮手術(shù)組織樣本進行scRNA-Seq研究，不可能對樣本進行組織病理學(xué)分類，并限制了進行批量處理的能力。在整合病人數(shù)據(jù)集時，這種阻礙往往會帶來技術(shù)上的偏差，并增加實驗成本。雖然之前已經(jīng)探索了組織保存方法來解決此類問題，但在復(fù)雜的人體組織上（如實體癌）和高通量scRNA-Seq平臺上，它還沒有被研究。

利用Chromium 10X平臺，對來自三個原發(fā)性乳腺癌、兩個原發(fā)性前列腺癌和一個皮膚黑色素瘤的新鮮和低溫保存的復(fù)制品共約12萬個細(xì)胞進行了測序。

三個原發(fā)性乳腺癌、兩個原發(fā)性前列腺癌和一個皮膚黑色素瘤樣本，首先將新鮮的手術(shù)標(biāo)本切成1-2mm3的小塊并充分混合，其中1/3立即用DMSO在-80℃下冷凍保存，命名為Cryoprerved Tissue（CT），剩下的2/3立刻用成熟的方法解離成單細(xì)胞懸液，其中一半單細(xì)胞懸液用DMSO在-80℃下冷凍保存，命名為cryopreserved cell suspension（CCS），剩下的一半單細(xì)胞懸液立即用10x平臺進行scRNA-seq，命名為fresh tissue（FT）。

低溫保存的樣品，包括CT和CCS，在-80℃下儲存約1周后，在-196℃的液氮中儲存長達5周，以模仿標(biāo)準(zhǔn)的組織生物庫程序。低溫保存后，CT和CCS樣本被解凍，并以與FT樣本相同的方式進行scRNA-Seq處理。

分別對來自乳腺癌患者1-3期（BC-P1、BC-P2和BC-P3），不同處理方式FT、CCS或CT的樣本進行了詳細(xì)的比較，這三種保存方式呈現(xiàn)出一致的 “可混合性”和強烈的重疊性。

研究發(fā)現(xiàn)，所有乳腺腫瘤集群中三種保存條件下的細(xì)胞均勻分布一致，通過分析典型細(xì)胞類型標(biāo)志物的表達，發(fā)現(xiàn)在低溫保存的樣本中，主要細(xì)胞系得到了強有力的保存。

基因表達和轉(zhuǎn)錄組的完整性是否在低溫保存過程中受到影響，首先檢查了每個細(xì)胞在低溫保存復(fù)制中檢測到的基因和獨特分子標(biāo)識符（UMI）的數(shù)量，M-P1（來自CCS和CO）與FT相比，每個細(xì)胞的平均基因數(shù)和UMI數(shù)較低。同樣，只有一個BC-P1樣本CT與FT相比，每個細(xì)胞檢測到的基因和UMI數(shù)量明顯較低。

接下來調(diào)查了FT樣品和低溫保存樣品之間的基因相關(guān)性，聚類相關(guān)顯示出與比較一致的趨勢，其中CCS樣本顯示出比FT樣本略高的R2相關(guān)性；

這些數(shù)據(jù)表明CCS樣本的scRNA-Seq產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量略高于CT樣本的數(shù)據(jù)，低溫保存可以為scRNA-Seq保存高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組。

三種不同的樣本處理方式在所有癌癥病例中檢測到的總路徑有很好的重疊，在所有病例中，超過64%的所有FT路徑在兩個冷凍保存的樣本中被一致檢測到，重疊率最小為64%，最大為77%，雖然這可能反映了基因表達程序可能受到低溫保存過程的影響，但這些途徑大多是在不同的細(xì)胞類型中檢測到的，從低溫保存樣本中檢測到的GO路徑的高度一致性來看，認(rèn)為這些微小的差異可能是由于scRNA-Seq平臺的變化導(dǎo)致的，而不是低溫保存過程導(dǎo)致的。

使用15種典型細(xì)胞類型的標(biāo)記物對一個冷凍保存為CT的乳腺癌病例進行了CITE-Seq。首先使用來自RNA表達的典型標(biāo)志物的組合來廣泛地注釋集群。通過CITE-Seq，能夠驗證細(xì)胞類型注釋，顯示相應(yīng)細(xì)胞類型上典型標(biāo)志物的高度特異性抗體衍生標(biāo)簽（ADT）表達水平。該研究表明高質(zhì)量的CITE-Seq免疫分型數(shù)據(jù)可以從低溫保存的CT組織的細(xì)胞中產(chǎn)生。這種方法可用于從冷凍臨床組織中提取額外的有力的表型信息，有助于單細(xì)胞簇的注釋和臨床相關(guān)分子的檢測，如免疫檢查點。

結(jié)論

通過對三種不同條件下的細(xì)胞進行了詳細(xì)分析，以評估冷凍保存對細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞質(zhì)量、聚類和基因本體識別的影響。此外，使用CITE-Seq對固體組織碎片冷凍保存的單個乳腺癌樣本進行了單細(xì)胞免疫分型。從新鮮組織中發(fā)現(xiàn)的腫瘤異質(zhì)性在低溫保存的樣本中基本保持不變。結(jié)果表明，從低溫保存的組織或低溫保存的單細(xì)胞懸液得到的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)與從新鮮組織中得到的細(xì)胞測序數(shù)據(jù)相當(dāng)，而低溫保存的細(xì)胞懸液在基因表達方面顯示出比新鮮組織更高的相關(guān)性，說明低溫保存對下游分析的結(jié)果（如生物途徑富集）的影響很小。對于一些腫瘤，與新鮮保存的組織相比，冷凍保存適度地增加了細(xì)胞應(yīng)激特征。此外，該研究證明了冷凍保存的全細(xì)胞對于使用CITE-Seq檢測細(xì)胞表面蛋白的優(yōu)勢，而使用其他保存方法（如單核測序）是達不到這個效果的。該研究表明可行的人類癌癥樣本低溫保存為多組學(xué)分析提供了高質(zhì)量的單細(xì)胞。該研究為組織生物庫的新實驗設(shè)計提供了指導(dǎo)，以用于未來的臨床單細(xì)胞RNA測序研究。