Western Blot是生物修煉的一大實驗，現在不做定量Western Blot，都不敢自詡學霸的了，暗暗擦汗的有沒有？在討論如何從Western Blot中獲得定量數據之前，先定義一下我們所說的“定量”是什么意思是非常有用的，何為定量，必須符合下列準則： 使用一個定義的過程進行檢測，即Western Blot。

這個過程產生一個可重復的結果，即是精確度。

測量反映了一個“真實”的結果，即是準確度。

定量Western Blot除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，是一定要檢測內參的，也就是內部參照（Internal Control），目的是校正蛋白質轉印和上樣過程中導致的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。對于哺乳動物細胞表達來說，內參通常指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用其作為參照物。

在發表文章時，Western Blot實驗結果需內參進行校正，但仍有一些科研人員在實驗中忽略內參的使用，將蛋白濃度測定作為規范是比較各種樣品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質濃度定量方法，都存在局限性，例如BCA方法對還原性試劑兼容性差，Bradford方法對去垢劑兼容性差，A280方法影響因素比較多，不能完全準確的確定各種樣品的蛋白濃度。在Western Blot實驗時使用內參，即可簡便地對轉印和上樣步驟產生的誤差進行校正。

那么如何實現Western Blot實驗中內參的檢測呢？簡單講就是在WB過程中，除加入靶標蛋白的抗體外，也加入內參蛋白的抗體，同時實現靶標蛋白和內參蛋白的檢測。通過歸一化，可以校正上樣誤差和轉印誤差，從而獲得比較準確的Western Blot結果。

使用熒光方法進行定量Western Blot檢測，可進行多重檢測，熒光信號穩定，持久，影響因素少，不用剝離膜和剪膜，實驗條件一致，更容易獲得定量Western Blot的數據。Azure600可以同時進行4通道熒光成像，無需剝離和重孵育，靶標蛋白和內參蛋白同時在一張印跡膜上成像，更容易被期刊雜志接收。

如果蛋白表達是高豐度的，可見熒光方法也可以嘗試，如果是3色RGB可見熒光，能夠同時檢測兩種靶標蛋白和一個內參蛋白。