1、免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique)是在生物化學(xué)、顯微鏡技術(shù)和免疫學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測技術(shù),是用熒光標(biāo)記的抗體或抗原與被檢樣品中相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合,在顯微鏡下檢測熒光,并對樣品進(jìn)行分析的方法。它把顯微鏡技術(shù)的精確性和免疫學(xué)檢測的特異性、敏感性有機(jī)地結(jié)合在一起。這一方法的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高。根據(jù)熒光素標(biāo)記的方式不同,可分為直標(biāo)熒光抗體和間標(biāo)熒光抗體。

①直標(biāo)免疫熒光技術(shù):該方法是最早的免疫熒光技術(shù),是用已標(biāo)記了熒光素的特異性熒光抗體直接滴在含有相應(yīng)抗原的載玻片上進(jìn)行孵育,在熒光顯微鏡下觀察檢查結(jié)果。由于該方法的檢測敏感性低,且每檢查一種抗原都需要制備其特異的熒光抗體,應(yīng)用并不廣泛。反應(yīng)式如下:

Ag+Ab-熒光 Ag·Ab-熒光

②間標(biāo)免疫熒光技術(shù):該方法是應(yīng)用最廣的免疫熒光技術(shù)。是用特異性的抗體與切片抗原結(jié)合后,作為第一抗體,再滴加熒光素化的第二抗體,在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。通過二抗的結(jié)合,能將信號進(jìn)行放大,因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度,但是隨之帶來的高背景也降低了檢測的特異性,因而只需滿足種屬特異性,即可用于多種第一抗體的標(biāo)記檢測。反應(yīng)式如下:

Ag+AbAg·Ab+G-熒光Ag·Ab·G-熒光

③時(shí)間分辨熒光免疫分析法:該方法是同位素免疫分析技術(shù)。是用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體,根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn),測量波長和時(shí)間兩個參數(shù)進(jìn)行信號分辨。該法可有效地排除非特異熒光的干擾,極大地提高了分析靈敏度。

④補(bǔ)體法:該方法是間接染色法的一種改良法。是將抗原和抗體及補(bǔ)體三者結(jié)合為復(fù)合物后,再與熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體進(jìn)行反應(yīng),四者形成復(fù)合物,在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。補(bǔ)體法不但有與間接法相同的優(yōu)點(diǎn),而且只需要一種標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體,就可實(shí)現(xiàn)各種抗原抗體系統(tǒng)的檢測。該法雖敏感,但參加反應(yīng)的因素較多,故特異性差。

2、放射免疫檢測技術(shù)

放射免疫檢測技術(shù)(radioimmunoassay,RIA) 是目前靈敏度最高的檢測技術(shù),利用放射性同位素標(biāo)記抗原(或抗體),與相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合后,通過測定抗原-抗體結(jié)合物的放射性判斷結(jié)果。放射性同位素具有皮克級的靈敏度,且利用反復(fù)曝光的方法可對痕量物質(zhì)進(jìn)行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。

3、酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法,是將二抗標(biāo)記上酶,抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化底物的作用結(jié)合起來,根據(jù)酶作用底物后的顯色顏色變化來判斷試驗(yàn)結(jié)果,其敏感度可達(dá)納克級水平。常見用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)等。由于酶聯(lián)免疫法不需要特殊的儀器,檢測簡單,因此被廣泛應(yīng)用于疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及 BAS-ELISA。

間接法是先將待測的蛋白包被在孔板內(nèi),然后依次加入一抗、標(biāo)記了酶的二抗和底物顯色,通過儀器(例如酶標(biāo)儀)定量檢測抗原。這種方法操作簡單,但由于高背景而特異性較差,目前已逐漸被夾心法取代。反應(yīng)式如下:

Ag+Ab-125IAg·Ab-125I(測定其放射性)或Ag-125I+AbAg·125I·Ab

夾心法利用兩種一抗對目標(biāo)抗原進(jìn)行捕獲和固定,在確保靈敏度的同時(shí)大大提高了反應(yīng)的特異性。

4、免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)(immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl₄)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等的作用下,聚合成為特定大小的金顆粒,并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷,可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合,由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外,還可以與許多其他生物大分子結(jié)合,如 SPA、PHA、ConA 等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng),加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性,因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。此方法簡單,快速,廣泛應(yīng)用于臨床篩查。