菌株反復凍存對菌株有什么影響？低溫會使菌株細胞內的水分形成冰晶，從而引起細胞結構尤其是細胞膜的損傷。

細胞體積大者一般要比較小者對低溫更為敏感，而無細胞壁者則比有細胞壁者敏感。如果放到低溫（不是一般冰箱）進行冷凍時，會產生冰晶，冰晶呈針狀，極易導致細菌的嚴重損傷。用電鏡觀察，可見細菌的核膜上有大量針尖樣小孔，當從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會變大，故反復凍存，會對菌株造成極大損傷。

菌株保存要求
菌種作為一項重要的生物資源，對微生物學教學和研究是必不可少的。菌種保存方法因微生物的不同而異。在菌種保存過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內不發生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，故菌種保存方法多依據這三個因素而設計。

菌種保存方法有多種，最理想的為真空冷凍干燥法，具有保存時間長、成活率高、變異小等優點，但操作技術難度大，花費高，需特殊設備，一般單位不易做到，而一些常規方法，常因傳代次數多、易污染、易變異，給保存帶來諸多不利。

多年來，微生物學工作者們一直在研究摸索簡便而行之有效的菌種保存方法，遠慕生物總結了幾種方法簡便、效果好的保存方法，現介紹如下。 需要4℃冰箱保存的保存法

1、液體石蠟保存法
先將液體石蠟滅菌，然后放于37℃恒溫箱中，使水汽蒸發掉備用。再將需要保存的菌種在最適宜的斜面培養基中培養，用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長好的斜面培養基上，用量以高出斜面頂端1cm 為準。試管需直立，置4℃或室溫下保存，一般無芽胞細菌可保存1年左右。

2、高層半固體瓊脂石蠟保存法
將需保存的菌種經平板劃線分離后，挑單個菌落用接種針反復穿刺接種到高層半固體瓊脂培養基中，經37℃12小時培養后取出，用無菌操作將滅菌的液體石蠟滴加半固體瓊脂菌種管表層約0.5cm高度，存放4℃冰箱，1年轉種1次。

3、蒸餾水保存法
取滅菌蒸餾水6-7ml加于試管斜面上，用吸管研磨，洗下菌苔充分混勻，將此菌液分裝于滅菌的螺旋小瓶中，或用膠塞密封，置4℃保存可存活數年。

需-20℃冰箱冷凍保存的保存法

1、甘油保存法
甘油一生理鹽水保存液的制備：取甘油(分析純)8份加入生理鹽水2份，充分混合后，經121.3℃ 30分鐘滅菌備用。
將純化后的菌株根據菌種不同分別劃線接種于其最適宜生長的培養基上培養后，用接種針取典型菌落接種肉湯管37℃培養6-8小時(鏈球菌和奈瑟氏菌接種血清肉湯管，5-10%CO2環境下8-10小時培養，真菌直接用接種環取菌洗入肉湯管，不培養)。此為培養液。
將此培養液與保存液以5：2的比例混合分裝于滅菌的微量離心管，置-20℃冰箱保存(鏈球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用時需37℃水浴中快速解凍。
用上述方法保存一般菌株可存活3年以上，鏈球菌、奈瑟菌可存活12-15個月，且性狀未發生變異。此方法采用幼齡肉湯培養物效果好，且適用于鏈球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種。

2、低溫保存法
菌種保存液的配制：K2HPO4 12.6g，檸檬酸鈉0.98g，MgSO4·7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g加蒸餾水至1000mL，103.4KPa滅菌30分鐘，4℃保存備用。
將細菌接種于肉湯培養基中，37℃ 培養16-18小時，或斜面培養物刮取于生理鹽水中，然后加入等體積的菌種保存液，凍存于-70℃或-20℃冰箱中。
此方法也適合甲鏈、肺球、流感桿菌、百日咳桿菌、綠膿桿菌等耐受力低的細菌。-70℃保存10年以上，-20℃可保存2年以上。

3、細菌濕種牛奶凍存法
新鮮牛奶或15%奶粉煮沸，冷卻脫脂，分裝小試管，每管1ml，8磅15分鐘滅菌備用。
將純種菌接種于平板，37℃16小時培養，以接種環刮取菌苔2-3環于牛奶中混勻，試管用硅膠塞，凍存于普通冰箱冷凍室(-12℃-18℃)。使用時取出室溫溶解，待部分溶解時即可取一環接種平板，并將試管再迅速凍存，這樣可反復使用3-5次。此法一般菌株可存活48個月，少數如奈瑟氏菌、甲鏈、白喉等可存活14-30個月。

4、甘油原液保存法
將各待保存的菌種純化后用接種環直接從平板上刮取，置于盛有0.5mL甘油原液的菌種瓶中，-20℃保存，可連續52個月存活良好。
此法尤其適合乙鏈、破傷風桿菌、產氣莢膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌種，是一種簡便實用的有效保存方法。

需低溫-30或-70℃冰箱保存

1、 脫纖維羊血
無菌抽取羊頸靜脈血后，沿瓶壁注入無菌的帶玻璃的三角燒瓶中，同時立即同一方向振搖約8-10分鐘，脫去纖維，然后分裝加蓋無菌小試管中約1.0-1.5mL。將腦膜炎雙球菌、淋球菌、甲乙型鏈球菌、肺炎雙球菌分別接種于血平板培養基中，前兩者置于5-10% CO2 燭缸內，經35℃16-18小時培養，后三者置37℃恒溫箱培養24小時，然后無菌操作取一接種環菌苔移種于上述新鮮脫纖維羊血試管中，立即置-3O℃冰凍保存二年轉種一次。用時室溫自然冰融即可接種。

2、 紙片法
新華定性濾紙剪成4mm×4mm，1.5mL帶蓋離心管消毒滅菌備用，用消毒小鉗子鉗上濾紙片于平板上刮取待保種的純菌落2-3個。放于離心管內塞蓋再用封口膠布將蓋邊緣封好放于-30℃冰箱保存。保存12個月后取出菌種解凍后用無菌鉗取一片放于肉湯管內37℃培養12小時后轉種血平板，性狀未變異。

3、 奶粉液菌種保存法
菌種保存液：脫脂奶粉10g，NaCL 10.5g，加雙蒸水100mL，121℃ 5分鐘高壓滅菌后分裝于1mL帶蓋無菌標本杯中(0.5mL)備用。
無菌操作用4mm×10mm 無菌濾紙條蘸取新鮮菌少許，放存含奶粉液保存杯中，蓋好，封口膠封口，低溫保存。3年存活率達99.2% 。
使用時將標本杯取出，不等全部融化，上層有少許融化即用接種環取一少許接種于血平板分離即可。

結論
菌種是細菌工作中所不可缺少而又具有傳染性生物學因子。為了保證工作和安全，對菌種必須妥善保存和保管。保存菌種不僅要求不死，還要求其生物學性狀、生理特性、抗原性等方面不發生變異，這是保存菌種的重要環節。延長菌種存活期應注意：首先，待保存菌種須選擇生長期幼齡培養物，且制成濃菌液保存，以保證存活率。其次，高層半固體培基最好選擇不含或含糖量低的培基，可減少或避免因代謝產物產生而造成的細菌死亡。最后，保存溫度的高低可影響存活率，切忌反復凍融。

以上介紹的幾種方法，取材簡單，操作容易，已經反復實踐證明保存時間長，變異小，適合中小型實驗室使用。