WB 是檢測和定量磷酸化蛋白質的重要實驗方法，然而大家一直都說磷酸化蛋白 WB 不好做！這是因為處于不同的細胞生長狀況和 / 或特定的細胞周期時，磷酸化蛋白可能僅占細胞總蛋白中的一小部分，處理不得當時，還會快速的去磷酸化。

磷酸化蛋白質 WB 做不好的原因有許多，比如封閉問題，抗體問題，或所需的磷酸化蛋白可能不存在于樣品中或者低于 WB 檢測的量。然而，有一個常被大家忽視的重要原因就是蛋白樣品制備所用的方法是否適合于磷酸化蛋白的提取？

其實蛋白質提取的方法不僅影響提取效率，還會影響蛋白的質量。大家目前最常用的方法是利用溶液法進行蛋白提取（如 RIPA 裂解液），但是往往會在蛋白質提取中產生兩個不同的組分，即 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性組分。

通常 RIPA 不可溶性組分被我們直接丟棄忽略。但是已經有文章證實許多蛋白質存在于被丟棄的 RIPA 不可溶性組分中 。也就是說利用溶液法提取的并非是完整的總蛋白，而僅僅是一些可溶性蛋白。

那使用 RIPA 等溶液法提取的不完整總蛋白做實驗，到底會不會影響我們磷酸化蛋白檢測和定量研究呢？我們來一起討論下。
1、將細胞裂解物分離成 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性組分，發(fā)現在兩個組分中都可以檢測到 TDP-43 的磷酸化片段。同樣的，用 RIPA 緩沖液裂解小鼠 MEC 細胞時，磷酸化的 EGFR（pY-1068 EGFR）只在 RIPA 可溶性組分中檢測出。

然而，磷酸化的 c-Src（pY-416 c-Src）則在 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶組分中都能檢測出， 甚至 WT 樣品在 RIPA 不可溶組分中的信號比 RIPA 可溶性組分中更強，結果表明如果僅使用 RIPA 可溶性組分進行實驗，則磷酸化 c-Src 丟失  。就是說使用溶液法提取的蛋白譜是不完整的，蛋白有非等比例的丟失，內參也有可能存在丟失情況，那么如果做磷酸化蛋白定量，就會出現數據偏差。

2、β整聯蛋白是一種磷酸化蛋白，使用 Chaps 進行原代雞胚成纖維細胞蛋白質提取，Chaps 不可溶組分使用 RIPA 裂解液再次提取，RIPA 不可溶組分再使用 sample buffer 提取，在五次采樣中，在 Chaps 不可溶組分和 RIPA 不可溶組分中都發(fā)現了大量的整聯蛋白 。

3、caveolin-1 的酪氨酸磷酸化（P-Cav-1）被發(fā)現是由 p38 絲裂原活化激酶和 c-Src 激酶的激活介導的 。當使用 Triton-X-100 和 RIPA 提取 NIH3T3 細胞時，在可溶性組分中未檢測到 caveolin 蛋白，僅在不可溶性部分 和（RIPA 不可溶組分但 SDS 可溶組分）中檢測到。 也就是說如果在這種情況下使用 RIPA 可溶性組分來檢測 P-Cav-1 將無法被檢出。

4、對于特定時間的特定樣品，磷酸化和非磷酸化蛋白質的總和代表該特定蛋白質的總量。在相同的 WB 檢測中， 磷酸化蛋白質的量增加通常伴隨著非磷酸化蛋白質的降低。

如果在蛋白質提取過程中蛋白質有一部分丟失，磷酸化和非磷酸化蛋白質之間的比例則可能被改變，會導致數據偏差。 以下數據使用兩種不同的蛋白質提取方法（SD-001，Invent Biotech, USA 基于柱式法的蛋白質提取試劑盒與 RIPA 緩沖液，未公開的數據）比較 p-stat-3 和 p-56 的磷酸化模式，（G.Szanda， NIH.NIAAA / LPS，USA）。

結果表明，對于 stat3 的磷酸化模式，處理（T）和基線水平（NT）樣品使用 SD-001(Invent Biotech, USA) 和 RIPA 緩沖液無明顯差異。 然而，p-56 的磷酸化模式的結果卻完全不同。

使用 SD-001 的裂解物，磷酸化的 p-56 在化學刺激（T）后從基線水平（NT）增加，同時伴隨著非磷酸化形式的降低，而 RIPA 緩沖液提取的樣品恰恰相反。 處理的（T）樣品中的磷酸化 p-56 小于基線水平（NT）， 這個觀察結果與預期不一致。 雖然確切的原因不清楚，但是蛋白丟失是導致這個結果的最大可能原因。 除了提取過程中的蛋白質損失外，還發(fā)現 RIPA 緩沖液人為增加激酶活性并潛在地影響蛋白磷酸化  。

總結
磷酸化蛋白 WB 做不好，很可能的原因是不適當的蛋白質提取方法影響了我們的研究。 因此，選擇適當的樣品制備方法對于磷酸化蛋白的成功檢測和定量至關重要。Invent 利用柱式法進行蛋白提取時，不產生不可溶性組分，無蛋白丟失，可以得到更準確的結果。