在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)候，給引物兩端設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn)，一般說(shuō)來(lái)，限制酶的 選擇非常重要，盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI、HindIII，提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點(diǎn)后，在各個(gè)酶的兩邊加上保護(hù)堿基，其原則可參照此處。

雙酶切時(shí)間及其體系：需要強(qiáng)調(diào)的是很多人建議酶切過(guò)夜，其實(shí)完全沒(méi)有必要，一般酶切3個(gè)小時(shí)，其實(shí)1個(gè)小時(shí)已經(jīng)足夠。應(yīng)用大體系，如100微升。

純化問(wèn)題：純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式，我推薦柱式，因?yàn)楦钅z手法不準(zhǔn)，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現(xiàn)在的柱式純化號(hào)稱(chēng)可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個(gè)堿基肯定也會(huì)被純化掉了。所以，PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。用的是TAKARA的純化柱試劑盒。 酶量的問(wèn)題：以TAKARA的為例，其對(duì)1單位酶的定義如下：在50 μl 反應(yīng)液中，30℃溫度下反應(yīng)1小時(shí)，將1 μg 的λDNA完全分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外，該酶可分解15 μg的DNA，而一般從1-4 ml菌液提出的 DNA約為3 μg，而PCR純化后的產(chǎn)物（50體系）約為3 μg，所以即便全部加進(jìn)去，只要純化的 質(zhì)量好，酶切完全切得動(dòng)。

1.  酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體的連接

摩爾比的計(jì)算，很多人憑經(jīng)驗(yàn)也可以。但對(duì)于初學(xué)者從頭認(rèn)真計(jì)算則 非常有必要。回收的載體片段：回收的PCR產(chǎn)物片段=1：10 ，一般取前者0.03 pmol，后者取0.3 pmol。

pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為μg單位的DNA：（X pmoles×長(zhǎng)度bp×650）/ 1,000,000 （注：長(zhǎng)度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數(shù)值即為μg,也可以直接用這個(gè)公式套.1 pmol 1000 bp DNA=0.66 μg，如載體是5380 bp，則0.03 pmol為

0.03×5.38×0.66=0.106524 μg。

測(cè)DNA濃度可以在專(zhuān)用機(jī)子上測(cè)，注意OD值，一般約1.8-2.0，另外，如果嫌麻煩，也可用MARKER進(jìn)行估測(cè)，如MARKER2000，5微升的 MARKER每個(gè)條帶約50 ng。

連接反應(yīng)：TAKARA的 連接酶上的 說(shuō)明寫(xiě)的過(guò)夜，而其對(duì)連接酶單位的定義為：在20 μl的連接反應(yīng)體系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16 ℃下反應(yīng)30分鐘時(shí)，有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。而它的濃度為350 U/μl ，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時(shí)間3個(gè)小時(shí)足已。

2.  轉(zhuǎn)化

a.  全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。

b.  42 ℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。

c.  加入890 μl AMP陰性培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。

取100 μl鋪板。也可離心后余100 μl。

幾個(gè)非常重要的問(wèn)題

1.  做轉(zhuǎn)化的時(shí)候,進(jìn)行酶連接反應(yīng)時(shí),注意保持低溫狀態(tài)，因?yàn)長(zhǎng)IGASE酶很容易降解，為保險(xiǎn)起見(jiàn)，一般連接3小時(shí)，16度。

2.  對(duì)含有AMP-RESISTENCE的質(zhì)粒鋪板時(shí)，注意加AMP時(shí)的溫度,溫度過(guò)高，會(huì)使克隆株無(wú)法篩選出來(lái).我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里，烤箱一般溫度為55-60度，然后做的時(shí)候拿出來(lái)，這樣好掌握溫度。鋪板前后注意用吹風(fēng)機(jī)吹干。

3.  對(duì)照的設(shè)立：

為驗(yàn)證雙酶切是否成功，可做如下對(duì)照：

A 酶切反應(yīng)時(shí)加各單酶分別切，兩管，用同一種BUFFER，跑膠，看單切的兩管是否成線性，如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功。

做轉(zhuǎn)化時(shí)也要進(jìn)行對(duì)照。

設(shè)4個(gè)：

A.  即拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物也進(jìn)行連接反應(yīng)，這個(gè)對(duì)照可進(jìn)一步看雙酶切是否成功，如果長(zhǎng)出克隆，說(shuō)明很有可能只進(jìn)行了單酶切，如沒(méi)長(zhǎng)出克隆，則證明雙酶切成功,當(dāng)然要保證感受態(tài)，培養(yǎng)基、連接酶都'正常'的情況下。

B.  酶切過(guò)的未進(jìn)行連接反應(yīng)的雙酶切產(chǎn)物,進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質(zhì)粒。

C.  設(shè)原始質(zhì)粒為對(duì)照，意為檢測(cè)整個(gè)操作過(guò)程中是否有誤。

D.AMP陰性板上用同一批感受態(tài)細(xì)胞鋪板20微升足夠，檢測(cè)感受態(tài)狀況。

3.  所有的試劑切記低溫保存

一步一個(gè)腳印，不要偷懶，圖省事最后卻更費(fèi)事，注意設(shè)立對(duì)照。

經(jīng)PCR鑒定，克隆90%-100%的陽(yáng)性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑選4個(gè)就足夠了。然后雙酶切鑒定，測(cè)序。