當(dāng)你徘徊在如何選擇二抗，或不知怎樣選擇最合適的二抗時，你的眼神告訴我，你糾結(jié)了，但是這不是你的錯。而當(dāng)看完以下內(nèi)容，你將不會再糾結(jié)，否則，那將是我的錯。

1. 弄清一抗的宿主物種是什么

二抗指向一抗的物種。如果使用來源于兔的一抗，則需要來源于除兔以外的其它物種的抗兔二抗。例如山羊多克隆抗兔IgG 二抗可以檢測兔多克隆抗 Ki67 一抗。換言之，二抗的宿主物種要求與一抗的宿主物種不同，而且種屬親緣關(guān)系越遠(yuǎn)越好。

2.了解一抗蛋白類型

二抗必須指向一抗同型。

多克隆一抗通常來源于兔、山羊、綿羊或驢，并且是IgG 同型。二抗通常為抗 IgG 重鏈和輕鏈的抗體。單克隆一抗通常來源于小鼠、兔和大鼠。例如，如果單克隆一抗為小鼠 IgG1，則 需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。
人免疫球蛋白類、亞類、型和亞型：

· 類或同型：IgG (γ heavy chains), IgM (μ), IgA (α), IgE (ε), IgD (δ)

· 亞類： IgG1 (γ1 heavy chains), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4); IgA1 (α1), IgA2 (α2)

· 型：κ light chain, λ light chain

· 亞型： λ1, λ2, λ3, λ4
其它類型的反應(yīng)：

· 多價抗體與所有免疫球蛋白類反應(yīng)

· 抗 Fc 或重鏈 (α, δ, ε, γ, and μ) 抗體僅與重鏈反應(yīng)

· 抗 F(ab) 或完整分子抗體與重鏈和輕鏈反應(yīng)，而與免疫球蛋白類無關(guān)

· 由于所有免疫球蛋白類均使用相同的 κ 和 λ 輕鏈，因此抗輕鏈（κ 和 λ）抗體 與所有免疫球蛋白類反應(yīng)

3. 需要酶學(xué)或熒光檢測嗎？

偶聯(lián)類型是依賴于應(yīng)用的。

對于酶學(xué)和生物素檢測，例如，在 WB 或 ELISA 中，建議將二抗偶聯(lián)于 HRP, AP 或 生物素。不論抗體宿主物種是什么，抗生物素蛋白和鏈霉親和素與生物素的結(jié)合作用均很強，并且均能使信號放大。 如果使用了激光，例如，在流式細(xì)胞術(shù)、ICC/IF 或 IHC 中使用時，則建議將二抗偶聯(lián)于熒光染料進(jìn)行熒光檢測。

4.有必要使用 F(ab) 或 F(ab')₂片段抗體嗎？

F(ab) ) 和 F(ab')₂片段抗體消除了抗體 Fc 部分與細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞、NK 細(xì)胞和 B 細(xì)胞）上 Fc 受體之間的非特異性結(jié)合，并且由于它們尺寸較小而能夠更有效地滲透組織。由于片段抗體不具有 Fc 部分，因此它們不干擾抗 Fc 介導(dǎo)的抗體檢測。

5. 是否需要親和純化的抗體或 IgG 片段？

使用親和純化的抗體或 IgG 片段的優(yōu)點將取決于預(yù)期的結(jié)合類型。親和純化的抗 體的非特異性結(jié)合量最低，而 IgG 片段包含高親和抗體。事實上，在親和純化中， 高親和力抗體保持固定在基質(zhì)上并且不能被洗脫。

6. 是否需要預(yù)吸附的二抗？

對于富含免疫球蛋白的組織和細(xì)胞，通常推薦使用預(yù)吸附血清的二抗于蛋白質(zhì)印 跡應(yīng)用。預(yù)吸附的二抗與內(nèi)源免疫球蛋白發(fā)生相互作用的可能性較低，因此可降 低非特異性背景。二抗進(jìn)行預(yù)吸附時，預(yù)吸附樣品應(yīng)來源于與檢測樣品相同的物 種。例如，在人組織中檢測時，將需要人預(yù)吸附抗體。

7. 是否需要抗 IgG 重鏈和輕鏈、抗輕鏈或抗 F(ab')₂ 二抗？

抗 IgG 重鏈和輕鏈的抗體同時與 IgG 亞類的重鏈和輕鏈反應(yīng)

抗輕鏈抗體與在所有免疫球蛋白類中均相同的一抗輕鏈反應(yīng)

抗 F(ab')₂ 二抗與一抗的 F(ab')₂ 部分反應(yīng)