實驗概要

本實驗介紹了微生物分離和純化的基本原理，旨在掌握常用的分離純化微生物的方法、菌落特征的觀察、微生物的幾種接種技術、建立無菌操作的概念及無菌操作的基本環節。

實驗原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落，通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特征后才能確定，有些微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。

土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用不同的培養基從土壤中分離不同類型的微生物。

將微生物的培養物或含有微生物的樣品移植到培養基上的操作技術稱之為接種。接種是微生物實驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。無論微生物的分離、培養、純化或鑒定以及有關微生物的形態觀察及生理研究都必須進行接種。接種的關鍵是要嚴格的進行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實驗結果就不可信，影響下一步工作的進行。

主要試劑

10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。淀粉瓊脂培養基(高氏I號培養基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，馬丁氏瓊脂培養基，查氏瓊脂培養基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板，營養肉湯，普通瓊脂高層(直立柱)。

主要設備

無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環，無菌培養皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細胞計數板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

實驗材料

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

實驗步驟

1. 稀釋涂布平板法

(1). 倒平板

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、高氏I號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基加熱溶化待冷至55～60℃時，高氏I號瓊脂培養基中加入10%酚數滴，馬丁氏培養中加入鏈霉素溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

(2). 制備活性污泥混合液稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換一支試管。

(3). 涂布

將上述每種培養基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對應平板培養基表面中央位置。

用無菌玻璃涂棒，右手拿無菌涂棒平放在平板培養基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養基。

(4). 培養

將高氏I號培養基平板和馬丁氏培養基平板倒置于28℃溫室中培養3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養2～3d。

(5). 觀察并挑菌落

將培養后長出的單個菌落根據其大小、顏色、形狀等特征進行觀察，之后根據菌落不同特征分別挑取少許細胞接種到上述三種培養基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養。若發現有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。

2. 平板劃線分離法

(1). 倒平板

按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培養基名稱、土樣編號和實驗日期。

(2). 劃線

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取上述10-l的活性污泥混合液懸液一環在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。

用接種環以無菌操作挑取活性污泥混合液懸液一環，先在平板培養基的一邊作第一次平行劃線3～4條，再轉動培養皿約70度角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養皿蓋，倒置于溫室培養。

(3). 挑菌落

同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認為純化為止。

3. 常用四種接種方法操作指導：

(1).   斜面接種法：斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。通常先從平板培養基上挑取分離的單個菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養物接種到斜面培養基上。操作應在無菌室、接種柜或超凈工作臺上進行，先點燃酒精燈。將菌種斜面培養基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對齊，應斜持試管呈45～50度角，并能清楚地看到兩個試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養基表面。以右手在火焰旁轉動兩管棉塞，使其松動，以便接種時易于取出。右手持接種環柄，將接種環垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環和絲）必須燒紅，以達到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應始終夾在手中如掉落應更換無菌棉塞。將灼燒滅菌的接種環插入菌種管內，先接觸無菌苔生長的培養基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環不能通過火焰，應在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環應通過火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細灼燒接種環后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標簽或用玻璃鉛筆劃好標記后再放入試管架，即可進行培養。

(2).   液體接種法：多用于增菌液進行增菌培養，也可用純培養菌接種液體培養基進行生化試驗，其操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同，僅將不同點介紹如下：由斜面培養物接種至液體培養基：用接種環從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養基時應在管內近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或將接種環在液體內振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時，若用接種環不易挑起培養物時，可用接種鉤或接種鏟進行。由液體培養物接種液體培養基時，可用接種環或接種針沾取少許液體移至新液體培養基即可。也可根據需要用吸管、滴管或注射器吸取培養液移至新液體培養基即可。接種液體培養物時應特別注意勿使菌液濺在工作臺上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過菌液的吸管或滴管，應立即放入盛有消毒液的容器內。

(3).  固體接種法：普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進行固體發酵。按所用菌種或種子菌來源不同可分為：用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養的種子發酵液。接種時按無菌操作將菌液直接倒入固體料中，攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計算在固體料總加水量之內，否則會使接種后含水量加大，影響培養效果。用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養的種子菌。將種子菌于無菌條件下直接倒入無菌的固體料中即可，但必須充分攪拌使之混合均勻。一般是先把種子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。

(4).  穿刺接種法：此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養基的接種，操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環。接種柱狀高層或半高層斜面培養管時，應向培養基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養基內左右移動，以使穿刺線整齊，便于觀察生長結果。