熒光蛋白的亮度與啟動子、表達方式和連接原件等有關，不同啟動子誘導熒光蛋白表達的強弱不同，如UBC相對于EF1α、CAG、CMV等強啟動子表達較弱。

融合或非融合表達與熒光強度也有很大關系，融合表達時熒光蛋白可能出現(xiàn)錯誤折疊等現(xiàn)象，導致檢測不到熒光信號或熒光較弱。非融合表達時一般選擇連接肽作為連接原件，如2A肽或IRES將ORF分隔開；選擇IRES，下游ORF的表達明顯弱于上游，2A肽可以避免上下游ORF表達強弱不一致的問題，因此更為常用，如P2A和T2A不過2A肽切割后容易有殘留氨基酸。

帶熒光的慢病毒感染細胞后，熒光的強度取決于病毒進入到細胞的顆粒數(shù)、細胞狀態(tài)、細胞類型、觀察時間等因素，熒光表達的強度與目的細胞感染病毒的顆粒數(shù)正相關，一般感染細胞后72h觀察熒光強度最佳，而增殖較慢的細胞可以適當延長時間。

也可能會遇到過表達的慢病毒比對照的熒光要暗的情況，這主要是因為基因的插入，會影響位于下游的熒光蛋白表達，對照或干擾的病毒由于沒有插入或插入序列非常短熒光不受影響，而插入基因后，尤其是較長片段和高GC片段，則會降低熒光強度。