蛋白表達問題一直備受關注，如何實現蛋白高效表達這個老生常談的話題，今天遠慕來探討一下。 影響蛋白表達的因素主要有：

1.載體構建錯誤
這個是很多克隆新人常犯的錯誤，在克隆時弄錯讀碼框，從而導致蛋白不表達。蛋白表達載體構建正確是蛋白表達實驗的基礎，構建載體時要考慮啟動子、多克隆位點、終止子、融合標簽、復制子等多種因素。

2.宿主菌選擇不當
不同宿主菌的基因型不同，選擇合適的宿主菌對某些特殊的載體進行蛋白表達至關重要。有時表達重組的毒素蛋白，對宿主細胞也有毒性，會造成質粒丟失。

3.GC含量
不同物種間基因組的GC含量有顯著差異，GC含量通常間接對基因表達進行調控和影響，超過70%可能會減低蛋白表達水平。

4.密碼子優化

（1）密碼子偏愛性
不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏愛性，甚至同物種內不同功能的基因其密碼子使用頻率也存在較大的差異，密碼子偏愛性對重組蛋白的表達具有深刻復雜的影響。
密碼子的偏愛性是通過控制可用tRNA豐度影響蛋白的翻譯過程，tRNA的缺乏可能導致對應的稀有密碼子在蛋白表達過程中使翻譯速率降低甚至終止，從而使蛋白水平顯著降低。

（2）密碼子的使用頻率低。
某些基因本身含稀有密碼子，擁有所用宿主的稀有密碼子越多的基因，越難在該宿主中表達出理想水平的重組蛋白。可選用高頻使用的密碼子替代基因中存在的已選宿主的稀有密碼子，或在排除原始基因中的稀有密碼子的基礎上進行重新合成，同時使密碼子組成頻率更接近宿主。
但是研究表明，密碼子的優化必須與蛋白的高級結構聯系起來，如果通過一味地替換稀有密碼子來提高重組蛋白的表達可能會起到適得其反的結果。

5.mRNA二級結構

mRNA如果形成大而穩定的二級結構如發卡結構和莖環結構，尤其是起始密碼子附近的穩定二級結構，將會影響mRNA在翻譯過程中核糖體的結合和延伸，從而降低翻譯的效率和最終的蛋白表達水平。
如果序列里有和核糖體結合位點/或翻譯起始位點互補的序列，由此形成的mRNA二級結構，會讓翻譯嘎然而止，此時就需要進行同義密碼子替換。
因此，合理優化翻譯起始區的mRNA二級結構，將有效提高目的蛋白表達水平。

6.mRNA的穩定性

蛋白的表達調控分為轉錄水平和翻譯水平，一般來說，轉錄水平起關鍵作用，但同時翻譯的效率與mRNA的降解直接相關，因此，也間接影響著轉錄后水平的調控。原核表達中，存在稀有密碼子的mRNA翻譯過程受到影響，使得mRNA得不到更多核糖體結合后的有效保護，也將導致mRNA的降解從而使蛋白積累水平顯著降低。

7.基因突變

堿基的缺失、插入或突變，都會對翻譯的蛋白產生影響，在PCR擴增時，堿基序列突變為終止密碼子，會導致蛋白翻譯意外終止。所以在進行表達之前，通常要進行測序來避免這種情況的發生。

當然，影響蛋白表達的其他要素或優化方法，還包括檢查單核苷酸重復和密碼子重復，起始密碼子環境，終止密碼子及其環境，避免內含子、AT 富含區、內部核糖體進入位點 (IRES)、重組位點等不利元件，選擇合適的 UTR 序列和信號肽序列，合理設計酶切位點、接頭、融合基因、檢測和純化標簽等。其他影響蛋白表達因素，歡迎小伙伴們補充。