熒光素標(biāo)記

熒光色素是最常用于標(biāo)記抗體的標(biāo)記物之一。熒光素經(jīng)恰當(dāng)?shù)募ぐl(fā)可發(fā)光，從而得知抗體的定位和待測抗原的分布情況，主要用于細(xì)胞分選或高分辨率免疫染色，是一種非常好的亞細(xì)胞水平精確定位的方法。

酶標(biāo)記

酶標(biāo)記抗體是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成，其應(yīng)用范圍非常廣泛，結(jié)果即時可見、敏感性高，但較難應(yīng)用于定量分析。

生物素標(biāo)記

生物素標(biāo)記反應(yīng)簡單、溫和且很少抑制抗體活性，將生物素與抗體共價結(jié)合是一種非常簡便、直接的標(biāo)記方法。

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）簡介

1941年，Coons等于首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescent antibody technique）。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。 一、熒光免疫技術(shù)的概念：

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。將抗原或抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)稱為免疫熒光素技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法。

二、熒光免疫技術(shù)分類：

（1）熒光抗體顯微鏡技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。

（2）免疫熒光測定技術(shù)： 抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法

三、熒光的產(chǎn)生：

物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以電磁輻射的形式釋放，即發(fā)光，這種光稱為熒光。這種物質(zhì)，稱為熒光素。由光激發(fā)所引起的熒光，為光致熒光；由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光，為化學(xué)熒光。

四、熒光素的熒光特性：

（1）停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止

（2）對光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性入射光波長<發(fā)射光波長

（3）熒光效率：熒光效率=發(fā)射熒光的光量子數(shù) /吸收光的光量子數(shù)

（4）熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱

五、常見熒光素：

（1）異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

（2）四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。

（3）四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｒ蚱錈晒獯銣缏部捎糜趩为?dú)標(biāo)記染色。

（4）鑭系：鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。

（5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564 nm，當(dāng)使用488 nm激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對于單激光器的流式細(xì)胞儀來說，推薦使用585±21nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用575±13nm的帶通濾光片。FL2探測器檢測PE。

（6）多甲藻葉綠素蛋白 （peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為35kD，最大激發(fā)波長的峰值在490nm附近，當(dāng)被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探測器檢測PerCP。

（7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中。在對DNA染色時，需用RNase對細(xì)胞進(jìn)行處理，以排除RNA對DNA熒光定量精度的影響。在488nm波長激發(fā)下，PI的發(fā)射光譜為610-620nm。 FL2探測器檢測PI。

常見熒光素的特性：

（1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

（2）RB200：橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光595~600nm，橘紅色熒光。

（3）TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。

（4）鑭系：Eu、Tb

（5）PE：吸收光490～560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。

（6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。

六、合適熒光素的選擇：

（1）具有與蛋白質(zhì)形成共價鍵的化學(xué)基團(tuán)。

（2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。

（3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。

（4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性。

（5）標(biāo)記方法簡單、快速。

（6）安全無毒 。