免疫熒光技術直接法測抗原實驗步驟

⑴基本原理

將熒光素標記在相應的抗體上,直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。

⑵試劑與儀器

磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

熒光標記的抗體溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進行稀釋

緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制

搪瓷桶三只(內有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)

有蓋搪瓷盒一只(內鋪一層浸濕的紗布墊)

熒光顯微鏡

玻片架

濾紙

37℃溫箱等。

⑶實驗步驟

① 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待檢標本片上,10min后棄去,使標本保持一定濕度。

② 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其完全覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內,保溫一定時間(參考:30min)。

③ 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗后,再按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不時振蕩。

④ 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。

⑤ 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度,一般可用“+”表示:

(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++ --++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上,而各種對照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。

⑷注意事項

1)對熒光標記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應超過1:20,抗體濃度過低,會導致產生的熒光過弱,影響結果的觀察。

2)染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化,染色時間可以從10 min到數小時,一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。

3)為了保證熒光染色的正確性,首次試驗時需設置下述對照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。

① 標本自發熒光對照:標本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。

② 特異性對照(抑制試驗):標本加未標記的特異性抗體,再加熒光標記的特異性抗體。

③ 陽性對照:已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。

如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,陽性對照和待檢標本呈強熒光,則為特異性陽性染色。

4)一般標本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現象,經熒光染色的標本最好在當天觀察,隨著時間的延長,熒光強度會逐漸下降。