熒光原位雜交技術(shù)（ fluorescence in situ Hybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法，用特殊的熒光素標(biāo)記核酸探針，在細(xì)胞或組織切片標(biāo)本上進(jìn)行雜交，以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) DNA 或 RNA 特定序列存在與否。

FISH 實(shí)驗(yàn)操作與用非熒光標(biāo)記探針的原位雜交基本相似。在組織準(zhǔn)備方面，新鮮組織、冷凍組織樣本、細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞爬片等材料均可以用于進(jìn)行FISH 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 以下談?wù)動(dòng)眉?xì)胞爬片進(jìn)行 RNA FISH 檢測(cè)的一些總結(jié)。

一、實(shí)驗(yàn)流程

1. 細(xì)胞在蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)好后用 CSK 緩沖液簡(jiǎn)單洗滌。

2. 細(xì)胞爬片用 4% 多聚甲醛在 4℃ 固定 10 min。

3. 用含有 0.5% TritonX-100,，10 mM VRC 的 CSKBuffer 溶液在 4℃ 處理 10-12 min。

4. 用 70% 酒精，4℃，孵育 10 min。

5. 在-20℃, 分別用 70%，85% 和 100% 的酒精處理 5 min，進(jìn)行脫水，最后風(fēng)干。

然后用中性樹膠將細(xì)胞爬片粘在載玻片上 （正面朝上）。

6. 探針的準(zhǔn)備，將加了探針的雜交緩沖液置于 76℃ 變性處理 10 min。

7. 將 5ul 雜交混合液滴在爬片上，蓋上蓋玻片，經(jīng) Rubber Cement 橡膠封片，置于潮濕暗盒中 37 ℃ 雜交過夜。

8. 雜交后，去除橡膠和蓋玻片，爬片用 50% 甲酰胺 (2XSSC 配) 在 42℃，洗 5 minX3，然后用 2XSSC 在42℃，洗 5 minX3。

9.DAPI 復(fù)染，取適量 DAPI 儲(chǔ)存液用 PBS 稀釋至 1ug/ml 的工作液，吸 5μL 滴爬片上，蓋上蓋玻片，黑暗室溫孵育 5min。去掉蓋玻片，在 PBS 中洗滌 2 次。去掉過量液體，滴加 antifade reagent 封片。

10. 熒光顯微鏡下觀察

二、注意事項(xiàng)

1、做 RNA FISH 實(shí)驗(yàn)，首先要防止 RNA酶的污染。操作過程中應(yīng)自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套，并經(jīng)常更換。所有實(shí)驗(yàn)用到玻璃制品都要高溫滅菌，且各種溶液要用 DEPC 水配制。

2、去污劑 triton X-100 處理的目的是增加細(xì)胞的通透性，利于雜交探針進(jìn)入細(xì)胞，其處理時(shí)間因應(yīng)不同的細(xì)胞而有所不同。注意：過度的去污劑處可能會(huì)引起靶核酸的丟失。

3、熒光見光就會(huì)淬滅，因此操作過程要做好避光。

4、將細(xì)胞爬片粘在載玻片上，確保有細(xì)胞的那面朝上。

5、實(shí)驗(yàn)所用探針是雙鏈 DNA 探針，而雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。因此在做 RNA FISH 雜交前，探針必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會(huì)重新復(fù)性。

6、探針的濃度因其種類和實(shí)驗(yàn)要求而有所不同，一般為 0.5-5ng/ul。合適的探針濃度要通過實(shí)驗(yàn)才能確定。

7、雜交反應(yīng)時(shí)，蓋玻片不可有氣泡，不然妨礙探針與細(xì)胞的接觸。

8、玻片經(jīng) antifade reagent 封片后可在 4℃ 暗處保存 2-3 星期而不失去全部熒光，但 FISH 操作完成后要及時(shí)觀察采圖。

9、如果鏡檢時(shí)，觀察到有非特異結(jié)合造成的高背景。可能原因有：不合適的探針量，不適合的雜交后洗滌，又或者是樣本中有過多的重復(fù)序列。解決方法：1）使用合適的探針量；2）改善雜交后的洗滌，如洗滌液要新鮮配制，增加洗滌液的量，延長(zhǎng)洗滌時(shí)間等；3）使用 DNA 阻斷劑，在探針中加入一定量的 DNA 競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑如 COT-1 DNA 或鮭精 DNA 來競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合基因組中重復(fù)性片段。