一. 目的
學(xué)習(xí)用濃鹽法從酵母中提取RNA
掌握用等電點(diǎn)法沉淀RNA
觀(guān)察核酸的顏色反應(yīng)，了解核酸定性與定量測(cè)定的原理
熟練掌握普通離心機(jī)的使用方法

二. 原理
酵母繁殖快，生長(zhǎng)周期短；其細(xì)胞質(zhì)中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液與菌體分離比較容易。因此，酵母是提取RNA的好材料。
將RNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)在工業(yè)上主要有三種方法—稀堿法、濃鹽法和自溶法。本實(shí)驗(yàn)采用濃鹽法，即利用高濃度的鹽（10% NaCl）在90～100°C條件下改變了細(xì)胞膜通透性，并將核蛋白體解離成RNA和蛋白質(zhì)而使 RNA釋放到鹽溶液中。同時(shí)，90～100°C的高溫可破壞磷酸單酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。注意，在30～70°C時(shí)這兩種酯酶的作用活躍，提取時(shí)應(yīng)避免在此溫度范圍內(nèi)停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。由于核膜內(nèi)的DNA分子量較大，穿越膜孔較困難，一般不易釋放到菌體外面，所以采用離心技術(shù)，可使RNA 溶液與菌體殘?jiān)约癉NA分離。

根據(jù)核酸在等電點(diǎn)溶解度最小的性質(zhì)，將溶液在低溫下調(diào)pH至2.0～2.5，RNA以白色絮狀沉淀形式從鹽溶液中析出。再次離心，固液分離，便可獲得RNA粗產(chǎn)品。
最后用乙醇洗滌沉淀，溶解和去除脂溶性雜質(zhì)和色素以及鹽分雜質(zhì)。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗滌還可以使RNA沉淀物脫水，變得疏松，便于干燥，提高了RNA產(chǎn)品的純度。

DNA和RNA的鑒別，較常用的方法是利用兩類(lèi)核酸中不同的戊糖各自具備的不同的顏色反應(yīng)，而得以定性鑒別。其中鑒定DNA的方法稱(chēng)為二苯胺法，鑒定RNA的方法稱(chēng)為地衣酚（苔黑酚，3,5-二羥甲苯）法。具體反應(yīng)式如下：

三. 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
1. 材料
干酵母

2. 儀器
離心機(jī)電子天平 沸水浴烘箱 抽濾裝置 冰浴

3. 器材
普通試管： 20mL×4（干燥）
錐 形 瓶： 100mL×1
量 筒： 50mL×1
移 液 管： 1mL×2
燒 杯： 250mL×1 100mL×1 50mL×1
離 心 管： 100mL×1
溫 度 計(jì)： 50℃×1
表 面 皿： f9cm
滴 管： 2
洗 耳 球： 2
加 樣 器
pH試紙： pH0.5～5.0
濾 紙： f7cm
洗瓶、試管架、移液管架、試管夾、玻棒：各1

四. 試劑的配制
1. NaCl溶液（C.P.）（10%）
2. HCl溶液（6N）
取500mL濃鹽酸，用水稀釋至1000mL。
3. 乙醇（C.P.）（95%）
4. 苔黑酚試劑（又稱(chēng)地衣酚試劑）
將200mg苔黑酚溶于 100mL濃鹽酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。
（低溫貯藏一周）
5. 二苯胺試劑
將1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL濃硫酸（比重1.84）。
（臨用時(shí)配制，用前可加幾滴乙醛。）

五. 操作步驟
1. 取材
在天平上準(zhǔn)確稱(chēng)取干酵母3.00g，轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶中。

2. 濃鹽浸提
取 27mL 10%NaCl溶液，加入到含干酵母的錐形瓶中，攪拌均勻；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分鐘；冷卻。

3. 離心
將錐形瓶中提取液和沉淀全部轉(zhuǎn)移至100mL離心管中，取10mL H2O洗滌錐形瓶，并入離心管中；平衡后以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心 15分鐘；將上清液（即RNA提取液）傾入50mL燒杯中，棄去沉淀（菌體殘?jiān)?br>
4. 沉淀RNA
(1) 冷卻：將50mL燒杯置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻；將溫度計(jì)插入50mL燒杯中，待溶液冷至10°C以下時(shí)，取出溫度計(jì)。
(2) 調(diào)pI：緩慢滴加 6NHCl于50mL燒杯中，用玻棒一邊輕輕攪拌溶液，一邊測(cè)量pH值，調(diào)節(jié)溶液pH至2.0～2.5范圍，溶液中白色沉淀逐漸增多，到等電點(diǎn)時(shí)沉淀量最多；繼續(xù)在冰浴中靜止15分鐘，使沉淀充分。
（注意：①?lài)?yán)格控制pH；②若攪拌過(guò)快核酸難以凝聚沉淀。）

5. 離心
將小燒杯中溶液和沉淀移至離心管中，再次平衡、離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘）；棄去上清液，保留RNA沉淀。

6. 洗滌與抽濾
(1) 洗滌：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的離心管中，懸浮沉淀，浸泡5分鐘。
(2) 抽濾：取大小合適的濾紙，先在數(shù)字顯示天平上稱(chēng)重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇濕潤(rùn)濾紙，開(kāi)啟真空泵，使濾紙貼緊漏斗，將沉淀及溶液全部轉(zhuǎn)移至布氏漏斗內(nèi)；再用15mL 95%的乙醇洗滌離心管，淋洗濾渣。

7. 干燥
用小鑷子取出布氏漏斗中的沉淀物和濾紙，轉(zhuǎn)移至表面皿上，置于80°C烘箱內(nèi)干燥。

8. 稱(chēng)重
取出樣品，在室溫下冷卻數(shù)分鐘后，將沉淀物及濾紙置于數(shù)字顯示天平上稱(chēng)重。

9. 顏色反應(yīng)
(1) 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同時(shí)加2滴NaOH助溶。
顏色反應(yīng)：取4支潔凈、干燥的試管，按下表所示順序操作

六. 結(jié)果處理
 1. 寫(xiě)出核酸產(chǎn)品的顏色和外形。
 2. 計(jì)算RNA的粗產(chǎn)品的得率。
 3. 由顏色反應(yīng)的結(jié)果，說(shuō)明產(chǎn)品中含有核酸的情況。