一、制片和染色的基本程序

微生物的染色方法很多，各種方法應用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。

1、制片

在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數過多聚成集團，不利觀察個體形態，可在載玻片之一側再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養物或固體培養物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。

2、自然干燥

涂片在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。

3、固定

標本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：

１）殺死微生物，固定細胞結構。

２）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。

３）改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易于染色。

固定常常利用高溫，手執載玻片的一端（涂有標本的遠端），標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。

以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應用較多普遍，但是應當指出，在研究微生物細胞結構時不適用，應采用化學固定法。化學固定法zui常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結構，故較常用。應用餓酸固定細胞的技術如下：在培養皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細管，在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標本涂片的載玻片，然后把培養皿蓋上，經過1—2分鐘后把標本從培養皿中取出，并使之干燥。

4、染色

標本固定后，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標本與染料的性質而定，有時染色時還要加熱。染料作用標本的時間平均約1—3分鐘，而所有的染色時間內，整個涂片（或有標本的部分）應該浸在染料之中。

若作復合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結合固定或染色同時進行。

５、脫色

用醇類或酸類處理染色的細胞，使之脫色。可檢查染料與細胞結合的穩定程度，鑒別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。

６、復染

脫色后再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復紅zui后進行染色，就是復染。

７、水洗

染色到一定的時候，用細小的水流從標本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

８、干燥

著色標本洗凈后，將標本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉，以免將菌體擦掉。

９、鏡檢

干燥后的標本可用顯微鏡觀察。

綜上所述，染色的基本程序如下：

制片→固定→媒染→染色→脫色→復染→水洗→干燥→鏡檢。

二、染色方法

微生物染色方法一般分為單染色法和復染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復染色法是用兩種或兩種以上染料，有協助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細胞各部分結構的（如芽胞、鞭毛、細胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。

１、單染色法

用一種染色劑對涂片進行染色，簡便易行，適于進行微生物的形態觀察。在一般情況下，細菌菌體多帶負電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結合而被染色。因此，常用堿性染料進行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復紅、結晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現強酸性（低于細菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。

單染色一般要經過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。

染色結果依染料不同而不同：

石碳酸復紅染色液：著色快，時間短，菌體呈紅色。

美蘭染色液：著色慢，時間長，效果清晰，菌體呈蘭色。

草酸銨結晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。

２、革蘭氏染色法

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫師Gram創立。

細菌先經堿性染料結晶染色，而經碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈現負反應。

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質上有很多差別，染色反應不一樣。現在一般認為革蘭氏陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結晶紫的復合物結合很牢，不易脫色，陰性菌復合物結合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應的主要依據。

另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結晶紫—碘復合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應嚴格控制。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

１）涂片固定。

２）草酸銨結晶紫染1分鐘。

３）自來水沖洗。

４）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

５）水洗，用吸水紙吸去水分。

６）加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分。

７）蕃紅梁色液（稀）染10秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。