質粒克隆載體的設計與構建原則
2024-05-06 10:08 作者：洛辰 來源：上海遠慕生物試劑
為了構建表達質粒的克隆載體，必須組裝合適的啟動子，當設計真核生物的基因須在原核生物中表達式，常改用原核生物或病毒(噬菌體)基因的啟動子，而原核生物基因在真核細胞中表達時，仍可用原核生物基因的啟動子。
質粒克隆載體的設計和構建的原則
①選擇合適的出發質粒
出發質粒也叫親本質粒，它應含有質粒克隆載體必備的元件，如復制起始位點、選擇標記基因、克隆位點、啟動子和終止子等。
②正確獲得構建質粒克隆載體的元件
一般采用限制性核酸內切酶切割出質粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA--片段，還可以采用PCR技術從靶DNA中擴增出含某種元件的特異性DNA--片段。
③組裝合適的選擇標記基因
構建的質粒克隆載體應該組裝什么樣的選擇標記基因，必須根據要轉化的受體細胞的特性來決定。
④選擇合適的啟動子
為了構建表達質粒的克隆載體，必須組裝合適的啟動子，當設計真核生物的基因須在原核生物中表達式，常改用原核生物或病毒(噬菌體)基因的啟動子，而原核生物基因在真核細胞中表達時，仍可用原核生物基因的啟動子。
質粒載體的分類
按復制形式
分為嚴緊型和松弛型復制。
根據質粒DNA復制與宿主之間的關系或在宿主細胞的拷貝數的多少，可以將質粒分為兩種不同的復制類型：嚴緊型和松弛型。嚴緊型質粒復制受宿主染色體DNA復制的嚴格控制，拷貝數較小一般只有1~3個拷貝。疏松型質粒的復制宿主的控制比較松，在宿主中的拷貝數比較多，一般有10~200個拷貝，有時可達到700個。
按基因轉移性
分兩類：（1）傳遞性質粒：常為大型、嚴緊型質粒；
（2）非傳遞性質粒：多為小型、松弛型質粒。
按遺傳性狀、產物分類
（1）抗生素抗性：如氨芐西林、氯霉素抗性；
（2）限制酶-修飾酶（R-M）系統：如hsdR-菌株可使DNA甲基化，但不限制外源DNA；hsd-菌株為限制和甲基化雙缺陷型。
人工構建的質粒載體分類
高拷貝數的質粒載體
ColE1、pMB1派生質粒具有高拷貝數的特點。適合大量增殖克隆基因，或需要大量表達的基因產物。
低拷貝數的質粒載體
由 pSC101派生來的載體特點是分子量小的拷貝數。它有特殊的用途：當有些被克隆的基因的表達產物過多時會嚴重影響寄主菌的正常代謝活動，導致寄主菌的死亡時，就需要低拷貝的載體。
失控的質粒載體
這是一類溫度敏感型復制控制質粒。如pBEU1、 pBEU2。
插入失活型克隆載體。載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因內部。如pDF41、pDF42。
正選擇的質粒載體
直接選擇轉化后的細胞。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養基上生長。
![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
