“跑膠”看到這個，已經進入實驗室學習的小伙伴想必不陌生，瓊脂糖凝膠制作膠板從而讓樣品在膠板上產生電泳，簡稱“跑膠”。通常跑膠分為跑瓊脂糖膠和 SDS-PAGE 膠，當然也還有非變性膠，這里主要說明上面兩種。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE 膠）

一、原理

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中 SDS 能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的 SDS 溶液中，與 SDS 分子按比例結合，形成帶負電荷的 SDS-蛋白質復合物，這種復合物會使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊。

從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由于 SDS 與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決于分子大小。

SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的有效分離范圍取決于膠的聚丙烯酰胺的濃度與交聯度。

各種需要用到的溶液配方

考馬斯亮藍染液

在 90 ml 甲醇：水（體積比 1:1）和 10 ml 冰乙酸混合液中溶解 0.25 g 考馬斯亮藍 R-250。用 0.45/0.22um 的膜抽濾，室溫保存。

脫色液

在 90 ml 甲醇：水（體積比 1:1）和 10 ml 冰乙酸混合液用 0.45/0.22um 的膜抽濾，室溫保存。

1X Tris-甘氨酸電泳緩沖液 （即 Running buffer）25 mmol/L Tris

250 mmol/L 甘氨酸

0.1%（m/V）SDS

同樣可以擴大配方為 5X 的儲存液。

30％ 丙烯酰胺混合液（100 ml）

29.2 g 丙烯酰胺（Acr）

0.8 g 亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）

10 g SDS 外包錫紙，4℃ 冰箱保存

二、制膠

選擇膠板（0.75 mm 或 0.1 mm 的，上樣量會有些差別，新手的話推薦 0.1 mm）制膠前先將膠板刷干凈，裝上以后用水先驗漏（5-10 min）然后倒掉水且從側邊將水用濾紙吸干。

根據你的蛋白大小來選擇一定濃度的膠。

注意最后加入 TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）（因為 TEMED 能夠通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺的聚合）先配下層膠每塊膠 5 ml，加到固定架子的夾子處即可（圖中紫色線所在的位置），然后用加水將膠壓平。

等待膠干（通過未加完的液來判斷）然后是上層的積層膠，先將上層水倒出吸干，再將積層膠加入，立即在其中插入一塊干凈的梳子，注意不要混入氣泡，然后在家一些積層膠溶液徹底填滿梳子之間的空隙，將膠垂直放置等待膠凝固。

每塊膠需配 1 ml，新手可配 2 ml，以防插梳齒時不順，還可以有補救的機會，同樣注意最后加入 TEMED，最后將液用槍均勻打入即可，待干了后即使用。

樣品處理

e.g. 6XSDS-PAGE 上樣緩沖 4 ul+蛋白液 20 ul 與小 EP 管中，將其放入沸水中 5 mln，再 8 000 r 離心 5 min。若有多余的孔道可以用上樣緩沖+水的混合物來填充。

裝好跑膠裝置

將膠專門的夾子夾住注意一定兩面均要夾上且夾緊，將整個膠架放入電泳槽中，先加入 running buffer 電泳槽至夾腳上方一點即可，再向膠中加入 running buffer。不要急于加樣，可以緩個幾分鐘看看是否漏液，漏的話需要重新用夾子固定膠。若不漏液，小心地將梳子拔下。

三、上樣

上樣盡量選槍頭細的槍，maker 最多上 10ul（條帶就很深了），上蛋白樣 10-20ul 均可（但其他孔道一定要保持一致，這樣才能保證各個孔道的條帶的平整），多出來的孔道要用上樣緩沖稀釋液來填充，不然最邊上的條帶會跑的歪向一邊，條帶會很丑。

跑膠

電壓一般設置 110 V，其他也是可以的，一般 85～150 V 都問題不大，電壓太大速度快但會產熱大，電壓太小速度太慢。根據所跑的目的蛋白的大小來定時間，若蛋白大小超過 100 kDa，可以讓藍色上樣緩沖跑出來后，再跑上 20 min；若蛋白的大小小于 15 kDa，則使藍色到整塊膠 4/5 處就可以停止了；若蛋白大小介于 15-100 kDa 之間，則使藍色到膠的末尾即可。這樣的目的是跑出來的目的條帶盡可能的處于相對中間的位置。

四、拍照

有些上樣緩沖中會加有免染的染料，就可以直接通過凝膠成像儀來直接成像。對于一般的情況還是要通過考染（將凝膠浸泡在至少 5 倍體積的染色液中，置平緩搖動的平臺上溫室染色至少 4 小時），在用脫色液褪色（同樣也要在水平的混勻儀器上搖）后在用凝膠成像儀來看即可。

瓊脂糖凝膠電泳

一、原理

瓊脂糖是 D-和 L-半乳糖殘基通過糖苷鍵交替構成的線狀聚合物，且瓊脂糖凝膠具有三維網絡結構，物質分子通過時會受到阻力，不同的大小的帶電物質在電場下涌動時受到的阻力不同，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

一般用于分離核酸分子，同時不同構象的核酸的遷移速率也不一樣，超螺旋環狀＞切口環狀＞線狀。不同濃度的膠適用的分離范圍也不一樣。

二、制膠

這里以 1% 瓊脂糖膠為例

緩沖 TBE：Tris-硼酸（TBE）

使用液

0.5X：0.045mol/L Tris-硼酸

0.001mol/L EDTA（pH8.0）

儲存液（1 000 ml）

5X：54 g Tris 堿

27.5 g 硼酸

20 ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

TBE 盡量用 5X 儲存，10X 的比較容易沉淀。

染料：溴化乙錠或 SYBR GOLD

制膠的第一步是選好梳齒，將膠架放上膠板，再放上梳齒。梳齒決定了膠的孔道的大小，盡量選擇厚的梳齒，梳齒的間距較大的，這樣一來既可以增加上樣量又能避免上樣時槍頭不小心破壞了膠孔。

第二步是取稀釋成 0.5X 的 TBE 25 ml，1000X 染料 2.5ul（根據具體染料的乘數來定），0.25 g 的瓊脂糖，放入在厚玻璃瓶中，用微波爐對其加熱至液體中沒有顆粒。

第三步是趁熱加到膠架上，調整梳齒（不要使梳齒靠到兩邊，不然挨著的孔會不能用了），趕氣泡（用槍頭將氣泡趕到邊緣，不然凝固的膠中有氣泡若在孔道中將會影響到樣的電泳速度，得到的條帶會不平整）。

三、上樣

待膠凝固好了，將膠架取下來放到電泳槽中，（若有多余的孔道可以切下來放入一次性手套中在 4 度保存），用 0.5XTBE 覆蓋膠。

然后上樣 Maker（根據你的樣的大小來定）最多 10 ul（如果你的樣的上樣量少可以酌情減少，這樣之后跑完膠照相是條帶的相對亮度會更好）；

樣（處理，用 loading buffer，根據 buf 的乘數來定）最多 20 ul 就足夠了。將膠擺正，蓋上蓋接上電源后（注意膠的擺放一定是向正極跑，不然你的樣都跑出去了，你就苦逼了）。

調好電壓和時間，一般為 110 V，不同的 DNA 大小不同時間也不太一樣，但原則上使 maker 跑到膠的 2/3 處就可以了。

四、拍照

用凝膠成像儀，調整好曝光度，保存條帶亮度差不多的即可。