1.  前言
了解活體的骨代謝狀態是研究相關細胞生理活性的一個有效方法。對骨組織進行堿性磷酸酶（ALP）染色后可以了解成骨細胞的骨形成情況，對骨組織進行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色可以了解破骨細胞的骨吸收情況。若在同一切片上進行雙重染色就能同時了解兩者的情況。另外，它有一個優點是在脫鈣標本里，只要可以雙重染色，無需專用的設備，僅用一般的設備就可以方便地觀察到骨代謝。在此前提下，我們需要研究探討雙重染色的可行性。

實驗材料及方法：
2.  標準標本的制作
用樹脂包埋法或凍結切片法制成的標本作為標準標本，與脫鈣的石蠟切片作比較。也就是說，酒精固定小鼠肘關節后，用乙二醇甲基丙烯酸甲酯（GMA）包埋，使用硬組織用的切片機制作成2μｍ的切片，然后進行TRAP與ALP染色（圖1）。繼而，制成脫鈣凍結切片（圖2）。之后，研究并改良在固定、脫鈣、染色各階段中雙重染色的可行性。
圖1. 標準標本（GMA樹脂包埋）

照片是小鼠的肘關節的染色標本，作為本實驗的標準標本。左上圖是TRAP染色，右上圖是ALP染色。下圖是兩者的雙重染色。以此作為陽性對照，與脫鈣石蠟切片一起進行染色及染色性的評價。
圖2. 脫鈣凍結切片的酶染色

用30%的庶糖液浸泡經檸檬酸脫鈣的小鼠腰椎及右上肢，然后經OCT復合物的包埋、Tissue-Tek PINO（Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.產品）的凍結、Cryo 3（Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.產品）的切割，得到5μｍ的凍結切片。切片進行酶染色。不僅可以進行TRAP染色（左圖：紅色）與ALP染色（中間：褐色）的單染色，還可以進行雙重染色（右圖）。
 
圖3. 經福爾馬林進行第一次固定的固定時間及TRAP/ALP的

染色性研究
①是沒有經過福爾馬林固定，只用酒精進行第二次固定的樣品，ALP染色顯強陽性。TRAP染色顯陰性。②是經福爾馬林16小時固定及③是4天固定后，TRAP與ALP都能很好地染色。然而，經福爾馬林固定一個月后的臨床樣本（骨軟骨腫）雖然TRAP染色顯陽性，但ALP不能被染色。
 
圖4.  不同種類的脫鈣溶液對雙重染色的影響
最左圖是選用酸性脫鈣溶液中對組織傷害較少的甲酸福爾馬林

脫鈣溶液脫鈣3天（Histra-DC,8～16℃）后的大鼠膝關節。TRAP與ALP都不能被染色。與此相反，中間的檸檬酸鹽酸鹽脫鈣溶液及最右的EDTA脫鈣溶液都可以使樣品脫鈣后進行TRAP/ALP雙重染色。

3.  關于固定
ALP染色使用不是由福爾馬林固定的新鮮材料，因此若不在短時間內固定，就會失去其酶活性。我們建議使用80%的酒精去固定。請驗證以下情況：

①    小鼠的膝關節不進行第一次固定，直接用酒精浸泡進行第二次固定組。
②    經福爾馬林（4％多聚甲醛溶液）第一次固定小鼠腰椎16小時后，再用酒精進行第二次固定組。
③    經福爾馬林進行第一次固定小鼠腰椎4天后，再進行第二次固定組。
④    臨床的樣本經福爾馬林進行第一次固定小鼠腰椎一個月后，再進行第二次固定組。

各組進行TRAP、ALP的雙重染色,并檢驗染色是否可行。圖3是染色的研究結果。在本實驗中，福爾馬林固定時間為16小時至4天的可以進行TRAP、ALP的雙重染色。

4.  關于脫鈣
ALP是含有金屬（Zn）的蛋白。脫鈣作用會使Zn也一并被除去而導致酶失去活性。為了彌補這個缺點，加入硫酸鋅（ZnSO4），使ALP活化。每100ml的脫鈣溶液加入0.4ml 1%的ZnSO4 溶液，以補充Zn。并且，在作為脫鈣溶液檸檬酸鹽酸鹽緩沖液中添加Zn的同時，加入相同量螯合劑EDTA溶液的相關研究在進行中。也有研究在酸性脫鈣溶液（甲酸福爾馬林溶液）中的酶是否能反應。結果顯示脫鈣溶液與檸檬酸一樣，在EDTA溶液中能很好地染色。相反，在甲酸福爾馬林溶液中不能使酶染色（圖4）。此外脫鈣方法是用超聲波脫鈣裝置（Histra-DC，普通光度）在8-16℃的低溫下，連續操作3-6天，使樣品脫鈣。脫鈣后用甘氨酸與佛羅那 （Veronal）緩沖液(pH7.4)洗凈，用磷酸鈣在組織上吸附，防止沉淀。

5.  關于染色
染色法使用的是Lorch的Gomori法。本實驗使用的是同時采用偶氮染色法和偶聯反應法的TRAP/ALP染色試劑盒（和光純藥，產品編號294-67001）。關于切片的厚度，Lorch建議為8μm，同時也研究過普通的4μm切片是否能染色、雙重染色的順序應該先染TRAP和ALP中的哪一個、封片劑是否必須選水溶性封片劑等問題。

染色法的結果是偶氮染色法中，切片過厚就會有酶擴散現象，即骨基質的TRAP染色傾向染成紅色。即使是4μm的切片，只要增強了反應條件（反應溫度及反應時間），也能充分染色。也就是說，TRAP染色反應溫度為室溫至37℃，反應時間為30分鐘至45或60分鐘。ALP染色可在37℃下反應45分鐘至3小時，也可在室溫（10~15℃）下延長反應時間至一晚。最后，可以得到兩者色調平衡、良好的染色結果（圖5）。但是，增強反應條件會使ALP染色的切片上產生更多的色素顆粒（圖2）。而TRAP與ALP的染色順序從任意一方開始都可以。但是，先ALP再TRAP染色時，陽性部位呈現明顯紅色，使用新鮮的破骨細胞染色，能得到相對好的標本。但是ALP的反應原產物因TRAP溶液而產生白色混濁顆粒狀體，會在組織上沉淀。因此，先TRAP染色再ALP染色的話會比較好。封片：用甲基綠，幾秒即可使核染色，水洗后在37℃下干燥，經二甲苯透明，經屈大麻酚(Marinol)永久封片。有文獻建議在透明前使用酒精脫水，但這會使反應產物浸出及擴散。
圖5. 脫鈣石蠟包埋切片的TRAP/ALP雙重染色
使用1歲小鼠腰椎的EDTA脫鈣石蠟切片進行TRAP/ALP雙重染色。破骨細胞的TRAP染色呈紅色，細胞活性強的細胞（成骨細胞、軟骨細胞）ALP染色為褐色。（上面：弱擴大，下面：強擴大）

6.  結語
TRAP與ALP兩種酶在每次固定、脫鈣、染色后，只要經過若干改良，就可以使脫鈣后的石蠟標本染色。但是，酶擴散現象，特別是在TRAP染色時這種現象更明顯。影響因素有多種，主要應該是受固定的影響，若固定不充分，脫鈣時很容易出現問題，從而導致酶擴散現象的發生。此外必須注意脫鈣自身的影響，也就是說，與非脫鈣標本相比，脫鈣標本觀察到的擴散現象較多。說明標本脫鈣很可能導致酶擴散。另外，也應考慮切片的厚度或雙重染色的順序影響。今后我們將向這個方向研究。