無蛋白封閉液——WB實(shí)驗(yàn)成功的重要一步
2019-09-23 11:58 作者：洛辰 來源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑
一提到WB封閉液，人們最先想到的就是脫脂奶粉和BSA，其封閉原理就是利用封閉液中的蛋白成分以吸附的方式結(jié)合于膜表面的空白間隙，從而避免一抗的非特異性結(jié)合。事實(shí)上，除了常規(guī)蛋白質(zhì)配方的封閉液之外，無蛋白-純化學(xué)配方的封閉液（BlockPRO TM protein-free Blocking Buffer）也具有很強(qiáng)大的應(yīng)用前景
作用原理
主要成分為碳?xì)浠衔铮?CHn、-C6H5，碳?xì)浠鶊F(tuán)以疏水性作用力結(jié)合PVDF膜或NC膜。
與常規(guī)蛋白配方封閉液相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
- 無蛋白配方，杜絕封閉液與蛋白樣品之間的相互作用
- 封閉更有效：小分子結(jié)構(gòu)小，空間位阻小，有利于充分封閉目標(biāo)蛋白周圍膜空間，又不遮蓋目標(biāo)蛋白區(qū)域
- 高信噪比：提供比傳統(tǒng)封閉緩沖液更好的特定信號和更少的背景噪聲
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
- 小分子封閉更有效，提升靈敏度，降低背景噪聲
Sample: THP-1 cell lysates ; Blocking time: 1 hour ;Target antigen: pAMPK ; Exposure time: 30 sec
相較于脫脂奶粉、BSA、Casein等蛋白質(zhì)配方封閉緩沖液，BlockPRO封閉緩沖液具有更好的信號強(qiáng)度
b. 無蛋白配方，不易滋生霉菌，延長抗體使用次數(shù)BlockPRO封閉緩沖液為純化學(xué)配方，不含蛋白質(zhì)，稀釋抗體可延長保存時間，抗體重復(fù)使用次數(shù)增加
應(yīng)用無蛋白封閉液，以下問題迎刃而解
問題1：使用脫脂奶粉作為磷蛋白檢測的封閉液，為什么檢測不到條帶？？
問題分析及解決辦法：磷蛋白信號本來就不強(qiáng)，脫脂奶粉中含有磷蛋白，產(chǎn)生了更多的非特異性信號；無蛋白封閉液為純化學(xué)配方，杜絕封閉液與蛋白樣品之間的相互作用，使用更有效
問題2：使用BSA作為封閉液，為什么有的時候會出現(xiàn)背景太高，特異性信號弱的現(xiàn)象？
問題分析及解決方案：BSA蛋白分子量很大，由于空間位阻可能在目的蛋白鄰近空隙進(jìn)行過度填充，遮蓋部分目的蛋白信號；無蛋白封閉液主要成分為化學(xué)合成的小分子，空間位阻小，有利于充分封閉目標(biāo)蛋白周圍膜空間，又不遮蓋目標(biāo)蛋白區(qū)域
問題3：用BSA或脫脂奶粉稀釋的抗體，放冰箱，第二次使用的時候發(fā)現(xiàn)臭了
問題分析及解決方案：封閉液中含有的蛋白容易滋生霉菌，即使放冰箱也不能長時間保存抗體；無蛋白封閉液中不含易滋生霉菌成分，可延長抗體保存時間
![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
