一、目的要求

掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化物的基本操作技術(shù)。

二、基本原理

1.從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。本實驗采用平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，其包括兩個方面：

（1）選擇適合于待分離微生物的生長條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物；

（2）微生物在固體培養(yǎng)基生長形成的單個菌落可以是一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等計數(shù)來完成的。

2.純培養(yǎng)的確定：

（1）確定其菌落觀察特征；

（2）結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征的確定。

三、器材

1.菌種：迷曲霉；

2.培養(yǎng)基：高氏Ⅰ號培養(yǎng)基，牛rou膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基；

3.溶液或試劑：10%酚 盛9ml無菌水的試管 盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂；

4.儀器或者其他用具：無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿、鏈霉素和土樣、顯微鏡、血細胞計數(shù)板等。

四、操作步驟

1. 稀釋涂布平板法

（1）倒平板：將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基， 高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基；馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃， 高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加入鏈霉素溶液。混勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿；

（2）制備土壤稀釋溶液：稱取土樣10g，放入盛有90ml無菌水并帶入玻璃珠的三角燒瓶，振動約20min，使土樣與水分混合，將細胞分散.用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一個盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀釋的土壤溶液；

（3）涂布：將上述每種培養(yǎng)基的三個平板地面分別用記號筆寫上10-4，10-5，10-6三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-4，10-5，10-6三管土壤稀釋液中各取0.1ml對號放入已寫好室溫下靜置5-10min，使菌液吸附進培養(yǎng)基；

（4）培養(yǎng)：將高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基平板;馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3-5天，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2-3天；

（5）挑菌落：將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)，大菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

2.平板劃線分離法

（1）倒平板：按稀釋涂布平板倒平板，并用記號標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，土樣編號和實驗日期；

（2）劃線：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線.劃線的方法很多，但無論采用那種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落；

（3）挑菌落：同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認為純化為止。