生命科學研究中組學技術的發展以及臨床醫療領域新一代檢測技術的進步，促進了對生物樣品的需求，也促進了生物樣品的采集、保存等環節的正規化、規模化。生物樣品的保存，不外常溫和低溫兩種方式。常溫保存能耗少、環保，有時也非常方便，是一種有潛力的保存方式。一些機構正在積極探索不同的常溫保存技術。上海遠慕生物也推出了RNAsafety?這種可用于組織的常溫采集和保存的試劑。生物樣品的低溫保存，則是目前較常用的生物樣品保存方式。

    生物和醫學上的低溫，是一個比較寬的溫度范圍。從大多數酶的zui適反應溫度37℃以下到幾個K（開爾文），都可以稱為低溫（絕對零度為-273.15℃ 即0K）。本文從樣品保存的角度，將低于常溫（室溫，25℃左右）的溫度理解為低溫。低溫能抑制生物體的生化活動，這是自然界固有的物理化學規律。根據阿侖尼烏斯（Arrhenius）方程，溫度越低，化學反應速度越慢，樣品的保存時間越長。因此，為了使生物樣品在一定的時間內保持穩定，人們按不同需求將樣品保存在4℃，-20℃，-80℃ 或溫度更低的冰箱中，或者保存在液氮中。本文談談生物樣品低溫保存尤其是凍存時需要注意的一些問題。

    1. 長期保存的組織樣品要盡快凍存

    樣品貯存的溫度對有效保存時間的影響很大。選擇合適的貯存方式和貯存溫度很重要。但為了保證實驗結果的客觀性，研究者也要充分注意樣品在貯存或固定前的處置時間和方式。樣品從開始收獲到固定或低溫保存前這段時間，仍有一些生化過程在較快地進行。這些生化反應的速度直到樣品被固定或者低溫保存時才顯著降低。這一段時間越短越好。對于手術切除的組織，熱缺血（warm ischemia）時間越短越好；對于實驗動物，處死取樣時掙扎時間越短越好。這有助于防止因環境改變而導致基因表達水平或蛋白磷酸化狀態產生較大變化。一些較復雜的手術可能進行幾個小時甚至整天，那么zui先被切割但未被切離的那部分組織可能經歷較長的熱缺血時間，從而導致較大的生化變化。為了盡可能減少熱缺血的影響，一些手術室專門放置了液氮容器，組織一旦切下就被投入液氮進行急凍（snap freezing）；對于耗時較長的手術，有人先在短時間內切下有代表性的小部分組織用于研究，然后再進行耗時較長的切除；有人在條件有限時，采用了將熱缺血狀態轉為冷缺血（cold ischemia ）狀態的辦法減少樣品的變化。他們先把切下的組織置于冰上或4℃ 冰箱中放置短時間，方便時再將樣品置于-80 ℃冰箱或液氮保存。總之，從樣品開始采集到被凍存或固定，這段時間越短越好，一般不要超過20分鐘。當然不同組織生化過程的變化快慢有異。當組織來不及凍存時，可將其剪成小塊，放于組織保存液如RNAsafety?中。

    2. 樣品凍存的優缺點

    相比于FFPE樣品，凍存組織的DNA 和RNA的得率高，片段長，質量好。可用于基因芯片和新一代測序等高通量基因組學檢測。不同于FFPE樣品，凍存組織內的蛋白質（如酶類）仍然保持生物活性，可用于某些檢測。但對凍存樣品，需要注意一些問題。凍存組織的形態學檢測效果有時不如FFPE樣品精細、完美（例如用于免疫組織化學檢測時）；某些病理組織內的一些感染性因子凍存后仍然保持活性，處理這些樣品時需要格外注意；組織樣品中的RNA在-80℃ 凍存時仍然不是長期穩定的，有人觀察到5年后RNA出現降解；核酸、蛋白質等大分子經過反復凍融，有可能斷裂成較小片段；凍存耗能較多，需要較多專門的空間，成本高昂；當凍存設備發生故障時，大批珍貴的樣品有可能被破壞，從而導致巨大的損失；當用液氮凍存樣品時，還要防范凍傷、液氮容器爆炸及因空間密閉等導致窒息等風險。

    3. 凍存溫度的選擇

    前已述及，根據一般的物理化學規律，溫度越低，樣品的穩定時間越長。在超低溫冰箱面世之前，-20℃ 冰箱是常用的低溫貯存工具之一。實踐證明，-20℃ 時組織內的大分子仍然可以被降解。而且，0至-60℃ 是水的結晶溫度。結晶容易對細胞和組織的微觀結構造成傷害，一般不在這一溫度范圍來保存組織和細胞。一些經過提純的大分子可以在這一溫度范圍內短期保存。目前，大多數生物和醫學研究機構用-80℃ 冰箱或液氮凍存生物樣品。-80℃低于危害性較大的結晶溫度范圍，也是常用設備超低溫冰箱能達到的溫度。但在-80℃溫度下，不同的生物樣品的保存時間是不一致的。組織中的DNA可以在-80℃下可以保持數年或更長時間。組織中的RNA在-80℃下的穩定性隨不同組織或細胞而異，但一般不超過5年。一些組織內的RNA在-80℃下不到一年就發生了降解。為了長期保存組織內的RNA，可以將組織切成尺寸小于0.5cm 的小塊，沒入5-10倍體積的RNAsafety?等組織培養液中，置于凍存管內，冰凍保存。RNAsafety?溶液能夠較好地維持RNA的完整性。甚至那些已知RNA酶含量較高的組織中的RNA也可以在RNAsafety?保存液中得以長期凍存。

    值得一提的是，為了避免因反復凍融引起組織內RNA的斷裂，有些研究者在短時間保存樣品時，采用組織保存液4℃保存，而不采用凍存法。

    為了保持生物大分子的活性，也可以采用更低的溫度保存樣品。-137℃是水的玻璃化轉變溫度。在這個溫度以下，生化活動極大降低。因此，制冷溫度可達-140℃至-150℃的深低溫冰箱，以及液氮，成為一部分研究者的選擇。液氮貯存在液氮罐中時，為了避免氣化的部分引起爆炸，液氮罐口常保留一定縫隙。但這個縫隙也導致了液氮液面和液氮罐口之間形成一個溫度梯度（-80℃至-196℃，可認為氣相氮溫度在-150℃左右）。為了避免樣本間的交叉污染，有些研究者傾向把樣品置于氣相中而不是液相中。但要注意液氮罐口的溫度是否達到了目標溫度。還要注意液氮的消耗狀況和操作液氮罐的安全問題。

    隨著制冷技術的進步，深低溫冰箱已經出現在某些實驗室。這類冰箱制冷溫度可達到-150℃。它不需要像液氮罐那樣需要頻繁監控液氮消耗情況。箱內溫度也比較均勻恒定，但深低溫冰箱降溫速度低于液氮，一旦開啟取放樣品時容易造成較大范圍的溫度波動，溫度恢復時間也相對較長。另外深低溫冰箱能耗很大，且必須保障供電。

    有些生物樣品的保存需要更低的溫度。液氮的液相部分可提供-196℃ 的低溫。樣本內的生化活動在此溫度下幾乎停止，樣本可以得到長期保存。液氮保存是樣品內細胞活性、組織器官的復雜結構及活性zui有效的長期保存方法。液氮保存被生物、醫學實驗室廣泛應用。液氮液相保存樣品需要防止樣品間交叉污染，要注意凍存管的選用，也要注意安全問題。

    干冰在生物可用于生物樣品的短時間內的保存或運輸。干冰自身溫度-78.5℃，呈固態，不滲漏，氣化后無毒，適于樣品的保存和運輸。但干冰只能在短時間內維持樣本的低溫，它自身不用于生物樣本的長期保存。另外，干冰的購買和伴隨運輸會產生一定的額外費用。在此我們建議在合適的情況下采用諸如之RNAsafety?類的化學保護劑代替干冰，進行樣品的采集和運輸。

    4. 結語

    生物樣品的低溫保存，是目前生物樣品的主要保存方式。在哪一溫度下進行保存，需要結合樣品本身的性質及實驗目的來確定。一般來說，組織樣品內的大分子比純化后的大分子不穩定，RNA比DNA更易降解。組織樣品、細胞樣品的迅速采集、迅速凍存或固定對于保存生物大分子的完整性很重要。在進行樣品的低溫保存時，輔以生物樣品保存液，例如RNAsafety?系列化學保護劑，可以幫助延緩大分子的降解進程，得到較理想的研究結果。