培養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)育BABY一樣，要精心照料，用心呵護(hù)。最好每天都去看看它們，滿足它們所需要的物質(zhì)需求，防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外，還要注意很多小細(xì)節(jié)，以免開展重復(fù)的實(shí)驗導(dǎo)致不必要的人力物力浪費(fèi)。
那培養(yǎng)細(xì)胞都要注意哪些小細(xì)節(jié)呢？就讓我們一起來看看吧！
1.細(xì)胞生長的營養(yǎng)來源
不同的細(xì)胞的培養(yǎng)基是不相同的，對于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞來說，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；為了防止污染，可以適時加1%雙抗，抗生素的使用應(yīng)為短期。
Q：細(xì)胞培養(yǎng)基配方如何選擇？
A: 一般購買細(xì)胞時，針對不同的細(xì)胞株，會有詳細(xì)的介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源肺癌細(xì)胞A549可用DMEM培養(yǎng)基，在胎牛血清的選擇上也可以選用大品牌、來源可靠的胎牛血清，能提供較好的營養(yǎng)成分，以滿足細(xì)胞株生長的需要。
Q：如果細(xì)胞生長緩慢，需要增加血清比例嗎？
A：可以。
2.細(xì)胞生長的環(huán)境
舒適無菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ)。需要合適的器皿，不同形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等，最終進(jìn)入合適的恒溫箱培養(yǎng)，如腫瘤細(xì)胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長。
Q：細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶如何選擇？
A：根據(jù)不同的應(yīng)用選擇不同的培養(yǎng)皿或容量板，如MTS用96孔板，細(xì)胞爬片用24孔，流式分析用6空等，具體應(yīng)用可參見下表：
而選擇培養(yǎng)皿還是選擇培養(yǎng)瓶，就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來說差別不大，主要是培養(yǎng)瓶的安全系數(shù)更高一些，數(shù)量也會大一些，但是成本也相對較高，因此沒有特殊要求時，一般用培養(yǎng)皿即可。
Q：血清是否要滅活處理，保證環(huán)境無菌？
A：這取決于您的應(yīng)用。
滅活過程中，會導(dǎo)致血清中某些成分被破壞，如氨基酸，維生素，生長因子等。所以只有在您的實(shí)驗對血清有特殊要求時，才會考慮對血清進(jìn)行滅活處理。如您的實(shí)驗對血清中的某種組分敏感，需要去除該組分。最常見的情況是需要去除血清中的補(bǔ)體蛋白，因為補(bǔ)體在機(jī)體中參與細(xì)胞殺傷，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，肥大細(xì)胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過程，所以一般在免疫學(xué)相關(guān)研究中及肌細(xì)胞和干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中需要對血清進(jìn)行滅活處理。
另外，用gamma 射線輻照血清可滅活血清中的病毒，一般情況下，25-40kGy和30-45kGy是常用的輻射劑量。
3.細(xì)胞復(fù)蘇與凍存
細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存的細(xì)胞解凍之后再重新培養(yǎng)，細(xì)胞從冷凍停止生長狀態(tài)恢復(fù)生長的過程。復(fù)蘇過程如下圖所示：
Q：細(xì)胞復(fù)蘇后，為什么很多難以貼壁？
A：忽略培養(yǎng)基的問題，主要考慮細(xì)胞凍存時狀態(tài)差或者復(fù)蘇時動作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-5～0℃）。
細(xì)胞凍存則是將細(xì)胞放在低溫（-70℃~196℃）環(huán)境，降低細(xì)胞內(nèi)的代謝活動，最大限度的保存細(xì)胞活力，以便長期存儲。
Q：目前細(xì)胞凍存液多采用的什么配方？
A：目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，細(xì)胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。
4.細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿空間有限，細(xì)胞過密生長就會受到抑制，影響細(xì)胞的狀態(tài)，因此我們要把細(xì)胞中的一部分分到別的培養(yǎng)皿里，這樣細(xì)胞才能生長的好。
Q：細(xì)胞傳代培養(yǎng)為什么要選擇對數(shù)期細(xì)胞？
A: 細(xì)胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數(shù)期（指數(shù)期），平穩(wěn)期（平臺期）和衰退期。為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細(xì)胞保持在對數(shù)期。一般細(xì)胞長到70%~80%左右就可以傳代了。
除了上述幾個環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)問題外，細(xì)胞培養(yǎng)還有很多小問題如下：
Q：培養(yǎng)基多久換一次？
A: 正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細(xì)胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細(xì)胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復(fù)蘇后的細(xì)胞，建議隔天換液。
Q：血清應(yīng)如何融解？
A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化過程中不時旋轉(zhuǎn)（swirling mix）混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。
Q：如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理？
A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。
Q：血清中出現(xiàn)絮狀沉淀是否需要去除？如何去除？
A：多種原因可能導(dǎo)致絮狀沉淀的形成，最常見的原因之一是融化過程中，脂蛋白聚集所致。該現(xiàn)象一般不會影響產(chǎn)品質(zhì)量。可以400g離心5分鐘，取上清，然后過濾。根據(jù)需要選擇合適的濾膜孔徑，一般最常用的是0.22um PES材質(zhì)的濾膜。為避免濾膜阻塞，建議離心后取上清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾而不是直接過濾血清。
總之，細(xì)胞培養(yǎng)是后續(xù)實(shí)驗的基石，留心各種細(xì)節(jié)問題，嚴(yán)守滅菌處理的程序，保護(hù)好自己養(yǎng)的細(xì)胞，這樣才能快樂地進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗。
![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
