盡管有了教科書、儀器說明書、產品操作指南和網絡教程，但周圍仍存在著多種錯誤的操作步驟，使電泳運行反復出現問題，并導致不適當的結果。迷你系統的相對低分辨率以及短運行時間常常掩蓋了這些問題。然而，在大型凝膠的高分辨率雙向電泳中，這也是蛋白質組學中最重要的分離方法之一，這些錯誤的后果會變得更為明顯。來自GE Healthcare Life Sciences的Reiner Westermeier博士指出了電泳中常犯的幾點錯誤。

1. 聚丙烯酰胺凝膠的交聯系數的錯誤計算
聚丙烯酰胺凝膠的孔大小是由兩種因素控制的：丙烯酰胺的總濃度T和交聯度C：
 
其中a是丙烯酰胺的質量，以g為單位，b是亞甲基雙丙烯酰胺的質量，以g為單位，V是體積，以mL為單位。

錯誤
有時候假設給定的丙烯酰胺總濃度T就是單位體積中丙烯酰胺的百分比，而交聯系數C就是單位體積中亞甲基雙丙烯酰胺的百分比。這導致凝膠中交聯劑的含量過高，產生了不透明的凝膠，不但易碎，而且高度疏水。

正確的操作
根據上面的等式配置溶液，或者使用即用型的丙烯酰胺/亞甲基雙丙烯酰胺儲備液，它可從不同的來源購買到。

2. 聚丙烯酰胺凝膠的聚合溫度和時間
丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的聚合通常在30分鐘至一小時內發生。然而，在這段時間內，基質的形成并沒有結束。所謂的沉默聚合仍在繼續，直至完整的基質形成。這一部分的聚合過程需要數小時，并且只在室溫（20-25°C）下才能高效開展。

錯誤
在有些實驗室，聚丙烯酰胺凝膠在冰箱或冷庫中聚合，或者在聚合開始后一個或幾個小時就已經使用。這可能會造成分離的干擾，尤其是當蛋白必須在天然條件下分離時。并且，若下游必須開展質譜分析，那么未完全聚合的丙烯酰胺單體或寡聚物會在質譜圖中產生高的背景噪音。

正確的操作
讓凝膠聚合在室溫下過夜進行。如果需要，凝膠可隨后儲存在冰箱或冷庫中。

3. SDS樣品中產生聚集物
單向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品通常須在1-2 % SDS和1 %（w/v）DTT（≈65 mM）或2 %（v/v）β-巰基乙醇（≈350 mM）存在時煮沸幾分鐘，以實現多肽鏈的徹底變性和解折疊。

錯誤
樣品常常在冷卻后直接上樣到SDS凝膠中。通常還原劑被部分氧化，其中一部分半胱氨酸不受保護，導致重折疊和多肽間聚集物的形成。重折疊形成模糊的區帶，有時是兩條帶。一些聚集物在高分子量區域形成了人為的區帶；其他聚集物則過大，無法進入凝膠，在點樣孔形成了沉淀聚集。還原劑的過量可能在整個凝膠上40-60 kDa的分子量范圍內形成兩條或三條水平線。

正確的操作
煮沸后讓樣品冷卻至60°C左右，然后加入碘乙酰胺。通常我們在100 μl樣品中加入10 μl 20%（w/v）的碘乙酰胺水溶液，并在室溫下孵育30分鐘。

通過這一步，我們可以獲得更為銳利的條帶，并排除了一些假象，如兩條帶、其他的高分子量條帶、點樣孔中的沉淀，以及凝膠上的線。

4. SDS電泳中運行緩沖液的滴定
到目前為止，大部分單向和雙向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的應用是在基于L?mmli的不連續緩沖液系統中開展的[1]。其他基于磷酸鹽、咪唑或其他緩沖液的均一系統表現出的分辨率和重復性不高。在不連續的“L?mmli”系統中，積層膠和分離膠緩沖液是由指定pH值的Tris和氯離子緩沖液組成的 – 其中含有或不含SDS，運行緩沖液中則包含SDS、Tris和甘氨酸。氯離子作為前導離子和甘氨酸作為尾隨離子之間的不連續性控制蛋白緩慢進入聚丙烯酰胺凝膠，并實現積層效應，產生非常銳利和清晰可辨的區帶。

錯誤
不幸的是，有一些操作步驟建議將Tris-甘氨酸緩沖液的pH調整至pH 8.3-8.4。這導致上層緩沖液槽中的氯離子載量過高，產生下列影響：分離將比預期時間要長得多，且一些區帶不好分辨。因氯離子相對其他所有離子有著非常高的電泳遷移率，所以只有氯離子向陽極方向遷移，直到上層緩沖液槽中沒有任何的氯離子剩余。到那時蛋白離子才會開始遷移。在大型的電泳槽中，這需要幾個小時至過夜。此外，積層效果也不如理想的不連續緩沖液那樣好。

正確的操作
只使用Tris堿、甘氨酸和SDS作為運行緩沖液。請勿滴定緩沖液，即使它的pH高于9。使用高質量的試劑。

參考文獻
[1] L?mmli , U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680–685.

5. 細胞中PBS的不徹底去除
在裂解細胞，分離出蛋白進行高分辨率的雙向電泳之前，必須用等滲溶液對細胞培養物中的細胞進行高效洗滌。通常使用PBS（磷酸鹽緩沖液）。

錯誤
PBS溶液有時未能從細胞中徹底去除。這導致樣品中的鹽污染，致使雙向電泳圖中出現許多長的水平條紋。

正確的操作
最后一次洗滌后，必須用移液器徹底吸光細胞中的PBS溶液，一滴也不剩。如果這不太容易做到，我們建議增加一步至三步洗滌，使用250 mM蔗糖和10 mM Tris（pH 7.0）的溶液。

6. 雙向電泳中IPG膠條的過度聚焦
到目前為止，高分辨率的雙向電泳為復雜蛋白混合物的分離帶來了最高的分辨率。因此，它是蛋白質組分析中十分常用的方法。理想情況下，生成的雙向圖顯示了所有蛋白的清晰可辨圓點。不幸的是，實際情況卻常常不是這樣：有時圓點的某些區域模糊，有時形成了水平或垂直條紋，取代了圓點。這些干擾可能有很多原因，過度聚焦就是其中之一。

如今在第一向分離即等電聚焦中大多采用了聚丙烯酰胺膠條，它們包含了固定化的pH梯度。由于pH梯度是固定在聚丙烯酰胺基質中的，所以當長期暴露在電場中時它不能散開。然而，過度聚焦會導致雙向圖像的一些其他干擾，具體會在下文中描述。

堿性pH梯度下的蛋白降解
當一些蛋白必須在它們的等電點停留一會時，它們不太穩定。實踐表明，一些堿性蛋白在它們等電點的pH下對水解特別敏感。這可能導致某些蛋白點延伸出水平條紋。因此堿性IPG膠條的聚焦時間應當限制在最少。

“硫脲效應”
根據Rabiloud[2]，在提取蛋白和水化IPG膠條時，向尿素中添加硫脲可提高疏水蛋白的溶解度。與只用尿素相比，生成的雙向圖顯示出明顯更多的點。然而，在某些情況下，在pH 5.5區域會形成一條很強的垂直條紋，而此條紋酸性一側的點會比凝膠其他部分的點更加模糊。這種現象可能會觀察到，但也并非存在于所有批次的硫脲中。但是它也與應用在IPG膠條上的伏小時相關。如果觀察到這種現象，建議降低應用在IPG膠條上的伏小時量。