養細胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顧小孩一樣仔細對待，愛護她，呵護她。上篇提到細胞培養的注意事項，反響熱烈，這次就來講講細胞培養常見問題的原因及對策。

1. 培養液 pH 值變化太快

原因：

CO2  張力不對

培養瓶蓋擰得太緊

NaHCO3  緩沖系統緩沖力不足

培養液中鹽濃度不正確

細菌、酵母或真菌污染

對策：

按培養液中 NaHCO3  濃度增加或減少培養箱內 CO2  濃度，2.0 g/L 到 3.7 g/L 濃度 NaHCO3  對應 CO2  濃度為 5% 到 10%。或者改用不依賴 CO2  培養液松開瓶蓋 1/4 圈加 HEPES 緩沖液至 10 到 25 mM 終濃度在 CO2  培養環境中改用基于 Earle’s 鹽配制的培養液，在大氣培養環境中培養改用 Hank’s 鹽配制的培養液丟棄培養物或用抗生素除菌

2. 培養液出現沉淀，pH 值不變

原因：

用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養基成分沉淀下來冰凍保存培養液

對策：

用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后除菌將培養液加熱到 37 ℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養液

3. 培養液出現沉淀，同時 pH 發生變化

原因：

細菌或真菌污染

對策：

丟棄培養物或用抗生素除菌

4. 培養細胞不貼壁

原因：

胰蛋白酶消化過度支原體污染培養液中無貼壁因子

對策：

縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物改變培養液成分

5. 懸浮細胞成簇

原因：

培養液中含鈣、鎂離子支原體污染蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋放 DNA

對策：

用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液分離培養物，檢測支原體。如發現支原體污染，丟棄培養物用 DNase I 處理細胞

6. 原代細胞培養物污染

原因：

原代培養組織在進入培養前已污染

對策：

培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織

7. 培養細胞死亡

原因：

培養箱內無 CO2

培養箱內溫度波動太大

細胞凍存或復蘇過程中損傷

培養液滲透壓不正確

培養液種有毒代謝產物堆積

對策：

檢測培養箱內 CO2

檢查培養箱內溫度

取新的保存細胞種

檢測培養液滲透壓。注意：大多數哺乳動物細胞能耐受滲透壓為 260～350 mOsm/kg。加入額外試劑如 HEPES 或藥物都有可能影響培養液滲透壓。

換入新鮮培養液

8. 培養細胞生長減慢

原因：

由于更換不同培養液或血清培養液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞培養物中有少量細菌或真菌污染試劑保存不當接種細胞起始濃度太低，細胞已老化支原體污染

對策：

比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。讓細胞逐漸適應新培養液換入新鮮配制培養液。補加谷氨酰胺或生長因子

用無抗生素培養液培養，如發現污染，丟棄培養物。或用抗生素除菌血清需保存在 -5 ℃ 到 -20 ℃。培養液需在 2～8 ℃ 避光保存。含血清完全培養液在 2～8 ℃ 保存，并在 2 周內用完增加接種細胞起始濃度，換用新的保種細胞分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物

9. 保存血清最-好的方法？

建議血清應保存在 -5 ℃ 至 -2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。

10. 如何解凍血清不會使其質量受損？

建議將血清從冷凍箱取出后，先置于 2～8 ℃ 冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。

11. 血清解凍后有絮狀沉淀物怎么辦？

血清中沉淀物的出現有許多種原因，但最-普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。

但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以 400 g 稍微離心，上清液即可接著加入培養基內一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

12. 為什么要熱滅活血清？

加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養 ES 細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

13. 有必要做熱滅活嗎？

實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。

而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是「小黑點」，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37 ℃ 環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

14. 儲存冰箱中的胎牛血清出現沉淀？

GIBICO 的胎牛血清沒有預老化，儲存在 2～8 ℃ 時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在 -20 ℃ 儲存胎牛血清，避免反復凍融。

15. 如何避免沉淀物的產生？

解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20 ℃ 至 4 ℃ 至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如 -20 ℃ 至 37 ℃），實驗顯示非常容易產生沉淀物。

解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。

請勿將血清置于 37 ℃ 太久。若在 37 ℃ 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。

血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請遵守 56 ℃，30 分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。