核酸的分子組成；

　　DNA的一級結構、高級結構及其功能；

　　幾種主要RNA(mRNA、tRNA)的結構與功能；

　　DNA的理化性質及應用。

　　重點：DNA的二級結構——雙螺旋結構的特點；DNA的變性復性特點及此特點在分子生物學中的應用是。

　　基本知識與理論：

　　一、核酸的化學組成

　　核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子。包括兩類：一類為脫氧核糖核酸（DNA），另一類為核糖核酸（RNA）。DNA存在于細胞核和線粒體內，攜帶遺傳信息；RNA存在于細胞質和細胞核中，參與細胞內遺傳信息的表達。核酸的基本組成單質是核苷酸，而核苷酸又是由堿基、戊糖、磷酸組成。

　　(一)堿基

　　構成核苷酸的堿基主要有五種，分屬嘌呤和嘧啶兩類。嘌呤類化合物包括腺嘌呤A和鳥嘌呤G兩種。嘧啶類化合物有三種，胞嘧啶C和胸腺嘧啶T尿嘧啶U。嘌呤和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵，因此對波長260nm左右的紫外光有較強吸收，這一性質可用于對核酸、核苷酸、及堿基進行定性定量分析。

　　(二)戊糖與核苷、核苷酸

　　戊糖是核苷酸的另一個主要成分，RNA和DNA主要區(qū)別有兩點：一是構成DNA的堿基為A、T、G、C，而RNA的堿基為A、U、C、G，二是構成DNA的核苷酸的戊糖是β-D－2-脫氧核糖，而構成DNA的核苷酸的戊糖為β-D—核糖。即RNA糖環(huán)上2號碳原子處連的是-OH，而DNA此處連的是-H。表示堿基和糖環(huán)上各原子次序時，在堿基雜環(huán)上標以順序1，2，3…；在糖環(huán)上標以l′，2′，3′… 以作區(qū)別。堿基與戊糖通過糖苷鍵連接成核苷。連接位置是C-1′。核苷與磷酸通過磷酸酯鍵連接成核苷酸連接位置是C-5′。此處可連接一個、二個、三個磷酸基團，稱為核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。體內還有一種核苷酸，即C-3′與C-5′與同一磷酸基團相連，在信號轉導中起重要作用。

　　二、DNA的結構與功能

　　DNA與蛋白質一樣，也有其一級、二級、三級結構。

　　（一） DNA的一級法構

　　指DNA分子中核苷酸的排列順序。由于核苷酸的差異主要表現在堿基上，因此也叫做堿基序列。

　　四種核苷酸按一定排列順序，通過磷酸二酯鍵連成主要核苷酸鏈，連接都是由前一核苷酸3′-OH與下一核苷酸5′-磷酸基形成3′-5′磷酸二酯鍵，故核苷酸鏈的兩個末端分別是5′-游離磷酸基和3′-游離羥基，書寫應從5′到3′。

　　（二）DNA的二級結構

　　即雙螺旋結構模型，要與蛋白質的α-螺旋相區(qū)別。

　　1．Chargaff規(guī)則

　　DNA分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的含量相等，鳥嘌呤與胞嘧啶的含量相等；因此DNA中嘌呤與嘧啶的總數相等：即A＋G=C＋T

　　2．雙螺旋結構模型

　　1953年Watson和Crick正式提出了關于DNA二級結

　　構的右手雙螺旋結構模型，主要內容有：

　　（1）DNA分子由兩條反向平行的多聚核苷酸鏈圍繞同

　　一中心軸盤曲而成，兩條鏈均為右手螺旋，鏈呈反平行走向，一條走向是5′→3′，另一條是3′→5′。

　　（2）DNA鏈的骨架由交替出現的親水的脫氧核糖基和磷酸基構成，位于雙螺旋的外側，堿基配對位于雙螺旋的內側。

　　（3）兩條多聚核苷酸鏈以堿基之間形成氫鍵配對而相連，即A與T配對，形成兩個氫鍵，G與C配對，形成三個氫鍵。堿基相互配對又叫堿基互補。RNA中若也有配對區(qū)，A是與U以兩個氫鍵配對互補。

　　(4)堿基對平面與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基對沿軸轉36°，上升0．34nm。每個螺旋結構含10對堿基，螺旋的距為3．4nm，直徑是2．0nm。DNA兩股鏈之間的螺旋形成凹槽：一條淺的，叫小溝；一條深的，叫大溝。大溝是蛋白質識別DNA的堿基序列發(fā)生相互作用的基礎，使蛋白質和DNA可結合而發(fā)生作用。DNA雙螺旋結構要與pr的相區(qū)別：DNA是兩條核苷酸鏈通過堿基之間氫鍵相連而成，而蛋白質的α-螺旋是一條肽鏈自身盤曲而成，其氫鍵是其內部第一位肽鍵的N-H與第四個肽鍵的羰基氧形成的。

　　（5）DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定主要由互補堿基對之間的氫鍵和堿基堆積力來維持。堿基堆積力是堿基對之間在垂直方向上的相互作用，可以使DNA分子層層堆積，分子內部形成疏水核心，這對DNA結構的穩(wěn)定是很有利的，堿基堆積力對維持DNA的二級結構起主要作用。

　　3．DNA結構的多樣性

　　DNA右手雙螺旋結構是DNA分子在水性環(huán)境和生理條件下最穩(wěn)定的結構，但并不是不變的，當改變溶液的離子強度或相對濕度時，DNA結構會發(fā)生改變，除了Waston－Crick模型（B－DNA）外，還存在Z－DNA和A－DNA

　　（三）DNA三級結構

　　真核生物DNA分子很大，DNA鏈很長，但卻要存在于小小的細胞核內，因此DNA必須在二級結構的基礎上緊密折疊，這就形成了三級結構。

　　1超螺旋——原核生物DNA的三級結構

　　絕大部分原核生物DNA是共價閉合的環(huán)狀雙螺旋分子，此環(huán)形分子可再次螺旋形成超螺旋，真核生物線粒體、葉綠體DNA也為環(huán)形分子，能形成超螺旋，非環(huán)形DNA分子在一定條件下局部也可形成超螺旋。

　　2.真核細胞基因組DNA

　　真核細胞核內染色體即是DNA高級結構的主要表現形式。組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成組蛋白八聚體。DNA雙螺旋纏繞其上構成核心顆粒，顆粒之間再以DNA和組蛋白H1連成核小體，核小體再經多步旋轉折疊形成棒狀染色體，存在于細胞核中。

　　(四)DNA的功能

　　DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復制的模板和基因轉錄的模板，是生命遺傳繁殖的物質基礎，也是個體生命活動的基礎。

　　三、RNA的結構與功能

　　RNA通常以單鏈形式存在，這與DNA雙鏈形成螺旋不同，但也可以有局部的二級結構或三級結構。RNA分子比DNA分子小，它的功能多樣，種類較多，主要有信使RNA、核蛋白體RNA、轉運RNA、小核RNA及核不均一RNA等。各類RNA在遺傳信息表達為氨基酸序列過程中發(fā)揮不同的作用。

　　（一）信使RNA（mRNA）

　　在細胞核內以DNA單鏈為模板轉錄生成hnRNA,hnRNA經過剪切變?yōu)槌墒斓膍RNA,出核后在胞質內為蛋白質合成提供模板。成熟mRNA的結構特點：

　　1具有5′端帽子結構

　　即在5′端加上一個7-甲基鳥苷；且原來第一個核苷酸C２′也是甲基化，這種mGpppGm即為帽子結構，

 

 

　　2. 3′端多聚腺苷酸尾

　　在mRNA3′端有一段多聚腺苷酸節(jié)段，是在轉錄后切掉一段多余的RNA后逐個添加上去的，這個多聚尾可能與mRNA從核內向細胞質的轉位及mRNA的穩(wěn)定性有關。

　　3生物體內mRNA種類多，含量少，代謝活躍，在各種RNA分子中，mRNA半衰期最短，這是細胞內蛋白質合成速度的調控點之一。

　　(二)核蛋白體RNA(rRNA)的結構與功能

　　rRNA是細胞內含量最多的RNA，與核糖體蛋白共同構成核糖體——蛋白質的合成部位，參與蛋白質的合成。核蛋白體由大亞基和小亞基組成。

　　1.原核生物：小亞基由16SrRNA和20多種蛋白質組成。

　　大亞基由5S、23SrRNA與30余種蛋白質組成。

　　2.真核生物：小亞基由18SrRNA與30余種蛋白質組成。

　　大亞基由5S、5.8S、28SrRNA和近50種蛋白質構成。

　　(三)轉運RNA(tRNA)的結構與功能

　　1.tRNA的一級結構

　　tRNA是細胞內分子量最小的一類核酸，含有大量稀有堿基：如甲基化的嘌呤、雙氫尿嘧啶、次黃嘌呤和假尿嘧啶核苷。假尿嘧啶核苷與一般的嘧啶核苷區(qū)別在于以雜環(huán)上C-5而非N-1與糖環(huán)C-1′

　　連成糖苷鍵。tRNA的作用是攜帶相應的氨基酸將其轉運到核蛋白體上以供蛋白質合成。

　　2.tRNA的二級結構

　　呈三葉草樣二級結構：一些能局部互補配對的區(qū)域形成局部對鏈，不能配對的部分膨出成環(huán)狀。此結構從5′末端起第一個環(huán)為二氫尿嘧啶環(huán)（Tφ），第二個環(huán)為反密碼子環(huán)，因其環(huán)中部的三個堿基可與mRNA中三聯體密碼子形成堿基互補配對，在蛋白質合成過程中解讀密碼子，把正確的氨基酸引入合成位點。第三個環(huán)為假尿嘧啶環(huán)（DHU），所有tRNA3′末端為CCA-OH結構，與氨基酸在此縮合成氨基酰-tRNA，起到轉運氨基的作用。

　　3．tRNA的三級結構

　　tRNA的三級結構呈倒L形，T與DHU在二級結構上各處一方，但在三級結構上卻相距很近，維系tRNA三級結構主要是依賴核苷酸之間形成的各種氫鍵。

　　（四）其他類型的RNA

　　如小核RNA（snRNA）參與hnRNA的加工。還有一類RNA分子本身具有自我催化功能，可完成rRNA的剪接。這種具有催化作用的RNA被稱為核酶。要與核酸酶區(qū)別，后者是指可水解核酸的酶，故按照底物不同可分為DNA酶和RNA酶。

　　四、核酸的理化性質及其應用

　　（一）核酸的一般理化性質

　　①核酸為多元酸，具有較強的酸性。②DNA是線性高分子，粘度極大，在機械力作用下易斷裂，因此提取DNA過程中應注意不能過度用力，比如劇烈震蕩吹打等。③由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長處有最大吸收峰，這個性質可用于核酸的定量測定。這要與pr在280mm波長處有最大的吸收峰相區(qū)別，又因為分子生物學實驗核酸提取過程中，蛋白質是最常見的雜質，故常用UD260/UD280來檢測提取的核酸純度如何。

　　（二) DNA的變性、復性和雜交

　　1．變性，這是DNA最重要的一個性質。

　　①DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結構松散，變成單鏈，即為DNA變性。DNA變性只涉及二級結構改變，不伴隨一級共價鍵的斷裂。②監(jiān)測DNA是否變性的一個最常用的指標是DNA在紫外區(qū)260nm波長處的吸收光值變化。因為DNA變性時，DNA雙鏈發(fā)生解離，共軛雙鍵更充分暴露，故DNA變性，DNA在260nm處的吸收光度值增加，并與解鏈程度有一定的比例關系，這種關系叫做DNA的增色效應。③DNA的變性從開始到解鏈完全，是在一個相當窄的溫度內完成的，在這一范圍內，紫外光吸收值增加達到最大增加值的50％時的溫度叫做DNA的解鏈溫度（Tm）。一種DNA分子的 Tm值的大小與其所含堿基中的 G＋C的比例相關也與DNA分子大小及變性條件有關，G+C的比例越高，DNA分子越長，溶液離子強度越高，Tm值越大。④加熱、低鹽及強酸、強堿均可使DNA變性。

　　2．復性

　　變性DNA在適當條件下，兩條互補鏈可重新恢復天然的雙螺旋構象，這種現象稱為復性。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程也叫退火，一般認為，比Tm值低25℃的溫度是DNA復性的最佳條件。

　　3．DNA復性的實際應用——雜交：通過變性DNA的復性性質，我們可知道，DNA單鏈之間、RNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間只要存在序列互補配對區(qū)域，不管是整條鏈互補，還是部分序列互補，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交，這在分子生物學研究中有極大的應用，比如：可用于在基因組中對特異基因的定位及檢測，PCR技術擴增目的基因等，很多分子生物學實驗技術應用的都是核酸分子雜交的原理，如Southern Blot, Northern Blot,包括PCR技術等。

　　五、核酸酶

　　指水解核酸的酶，根據底物不同分DNA酶、RNA酶，根據作用位點不同分核酶外切酶和核酸內切酶，其中限制性核酸內切酶在分子生物學技術中的應用尤為重要。