一.實驗原理

質粒可攜帶一種或多種抗生素抗性基因，其賦予攜帶它們的細菌對特定抗生素的抗性。研究人員可以通過人工選擇（即在抗生素存在下培養細菌），輕松地將含有該質粒的細菌與不含有該細菌的細菌分離。

Luria肉湯（LB）是一種富含營養的培養基，通常用于培養實驗室中的細菌。向LB中添加瓊脂導致形成細菌可以生長的凝膠，因為它們不能消化瓊脂但可以從LB內收集營養。向該凝膠中添加抗生素只允許選擇那些對該抗生素具有抗性的細菌 - 通常由攜帶抗生素抗性基因的質粒賦予。

LB瓊脂平板經常用于分離攜帶特定質粒的細菌的個體菌落。然而，液體培養物能夠支持更高密度的細菌，并用于培養足夠數量的細菌以分離足夠的質粒DNA用于實驗用途。

二.試劑及實驗器材準備

1.液體培養基配制：

胰蛋白胨Tryptone：10g

酵母粉Yeast：5g

NaCl：10g

dH2O定容至1000ml

2.LB平板配制:

胰蛋白胨Tryptone：10g

酵母粉Yeast：5g

NaCl：10g

瓊脂糖：12g（工作濃度6-25g/L）

dH2O定容至1000ml

3.無菌平板（不可高壓）：通常使用60 mm x 15 mm平板，200ml瓊脂澆筑4-5個平板（若瓊脂太少過夜孵育后容易干裂），可在其上單獨區分最多約100個菌落

4. Falcon細胞流式管（不可高壓）5.可高壓滅菌的燒瓶：（用1L瓶制備400ml瓊脂，在500ml瓶中制備200ml瓊脂，需要額外的空間防止沸騰。）

6.抗生素：1000倍的儲備溶液(氨芐青霉素鈉,庫存濃度100mg/ml，溶解后，0.22um過濾除菌，分裝，-20℃保存數月。加入培養基時一定要等滅菌后的培養基冷卻到40-50℃時再加入。含氨芐青霉素的培養基平板在4℃可保存2周。)
 

三.實驗步驟

1.溶解質粒： 將含目的基因質粒的 紙剪下（比畫得圈稍大），并剪成碎片，放入無菌EP管，加20到50ul無菌水或TEbuffer， 可用槍頭將濾紙搗碎，室溫過夜（或為了促溶，還可60℃水浴）。后漩渦振蕩5min，離心，取上清即為質粒用于后續轉化。

2.LB液體培養基、LB平板粉末 攪拌溶解后，121℃高壓滅菌半小時，高壓滅菌過程中高壓釜膠帶會變暗。液體LB 無菌環境下冷卻至室溫，放置4℃冰箱備用；LB平板 熔融凝膠混合物在凝固前轉入40-50℃（視抗生素加入培養基溫度而定）水浴鍋，至少5分鐘，備用。

3.準備培養皿、Falcon細胞流式管，紫外線消毒30min；（在培養皿上標記日期、抗生素特性。）

4.準備抗生素（要制備終濃度為100 ug/mL氨芐青霉素鈉的平板，則應制備100,000 ug / mL（100 mg / mL）的儲備溶液。測量100毫克氨芐青霉素鈉粉末，將其加入1毫升水中，通過渦旋溶解，并過濾滅菌。）

5.添加抗生素至LB液體培養基、LB平板熔融凝膠混合物中（溫度不宜過高，40-50℃（視抗生素分解溫度而定，氨芐青霉素鈉加入溫度為40-50℃），防止抗生素分解）

6.澆筑LB平板：澆注后將盤子旋轉以除去氣泡，確保瓊脂在板底部均勻分布，凝固后倒置。200ml瓊脂澆筑4-5個平板（若瓊脂太少——板過薄，過夜孵育后容易干裂）若澆筑過程瓶中的瓊脂凝固，可再次通過高壓滅菌器或微波爐將瓊脂重新液化（用微波爐時防止沸騰！）室溫下固化大約需要30min，在室溫下過夜使之干燥。在過夜干燥后，將板在4℃下（用PE手套包好）儲存直至使用。

7.取感受態細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷（提前冰上預冷1.5mlEp管）的離心管中，置于冰浴中。

注意：一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100ul，可以根據實際情況分裝。所用DNA體積不超過感受態細胞懸液體積的1/10。（根據加入質粒體積提前準備無菌10ul無濾芯槍頭）

8. 向感受態細胞懸液中加入目的DNA/ pUC19質粒（對照：證實感受態細胞是否有問題）（100ul的感受態細胞能夠被1ng超螺旋質粒DNA所飽和)，輕彈混勻，在冰浴中靜置30min。

9. 將離心管置于42℃水浴中放置60-90s，然后快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3min，該過程不要搖動離心管。

注意：此步驟也可將離心管置于室溫進行，夏季或室溫較高時，可放置5-8min， 如果室溫較低，可延長時間至8-15min。條件允許建議使用42℃熱激方法。

10. 向每個離心管中加入900ul無菌的LB培養基 （不含抗生素），混勻后置于37℃搖床振蕩培養45 min (將1.5mlEp管水平放置，充分搖混勻)，目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。

11. 將離心管內容物混勻，吸取100ul （第一次涂板，可設置不同的梯度：20ul、50ul、70ul、100ul）已轉化的感受態細胞加到含相應抗生素的LB固體培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收(15-20min)，倒置平板，37℃培養12-16h（過夜）。

注意：涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化的DNA總量較多，可取更少量轉化產物涂布平板；反之，如轉化的DNA總量較少，可取200-300ul轉化產物涂布平板。如果預計的克隆較少，可通過離心（4000rpm, 2min）后吸除部分培養液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養板。）

12. 使用無菌槍頭或牙簽，從LB瓊脂平板上選擇一個菌落。

13. 將槍頭或牙簽放入液體LB +抗生素中并旋轉。

14. 將細菌培養物在37℃下在振蕩培養箱中 180rpm孵育12-18h。

15. 孵育后，檢查生長，其特征在于培養基中的混濁霧度（見右圖）。

注意：良好的陰性對照是LB培養基+抗生素，沒有任何細菌接種。過夜孵化后，您應該看到這種培養物沒有生長。

對于細菌的長期儲存，選擇甘油。

1、配制30%（體積分數）的甘油水溶液,離心管若干滅菌備用.

2 、將細菌用富集培養基搖瓶培養過夜,根據保藏要求（有些要求高的項目中菌要達到一定OD值）培養.

3 、將菌液和滅菌的甘油水溶液按照2:1的體積比例在離心管中混勻（使最終甘油濃度為10%,其實甘油多點也沒關系）,-70°冰箱保存.

16. 用小提試劑盒從大腸桿菌培養物中分離質粒DNA。

17. 樣品進行電泳檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2ul，紫外燈下觀察，最明亮的帶為超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取質粒的純度。

18. 質粒純化

1) 將之前提取好的質粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L無菌乙酸鈉溶液。

2) 加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過夜。

3) 4℃，高速離心機14000rpm，離心20min.

4) 棄去上清，70%乙醇洗2次。

5) 空氣干燥，可置超凈工作臺干燥。

6) 加200ul無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質粒溶液。

7) 紫外分光光度計測量質粒濃度和產量。

四.提示和常見問題

(1)高拷貝質粒和低拷貝質粒有什么區別？

拷貝數是指單個細菌細胞內單個質粒的拷貝數。大質粒通常具有低拷貝數（每個細胞大約一個或兩個拷貝）并且它們需要生長更長的時間段（大約18-30小時）。另一方面，較小的質粒可以大量存在，每個細胞50個或更多，并且具有高拷貝數。高拷貝數質粒應該僅需要平均生長12-16小時。無論質粒大小如何，質粒的某些特征可使其低拷貝。請參閱質粒的信息頁面以確定您的質粒是高拷貝還是低拷貝。

(2)過夜孵化后，我沒有任何增長。什么地方出了錯？

嘗試將文化培養更多時間。一些細菌培養物生長得更慢。此外，在30°C而不是37°C溫育的細菌通常需要更長的孵育時間。

仔細檢查LB培養基中的抗生素是否與質粒上的抗生素抗性相匹配。

如果LB瓊脂平板上的細菌不是新鮮的，你應該將細菌劃到新的LB瓊脂平板上，然后在液體培養基中生長。

更多的曝氣可能有助于增加培養物的密度。通常培養物在150-250rpm下搖動，將其增加至350-400rpm以獲得更高的細胞密度。