在實驗過程中，我們常常需要證明實驗組相對于對照組某些蛋白質(zhì)是多了還是少了，那么我們就需要先把細胞或組織中的蛋白質(zhì)提取出來進行測量，今天就給大家介紹一下細胞與組織蛋白質(zhì)提取的基本知識和步驟。

    蛋白樣品制備的原則：

    1.盡可能采用簡單方法，以避免蛋白丟失；

    2.細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白質(zhì)的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可防止蛋白質(zhì)的降解；

    3.樣品裂解液應新鮮制備，并分裝存于-80℃，勿反復凍融已制備好的樣品；

    4.通過超速離心清除其余雜質(zhì)。

    一般的理解方法分為溫和的裂解方法和劇烈的蛋白裂解方法。
    溫和的裂解方法

    用于組成比較簡單的樣品，或分析某一特定的細胞器。

    （1）滲透裂解：血細胞、組織培養(yǎng)細胞

    （2）凍融裂解：細菌、組織培養(yǎng)細胞；液氮凍融

    （3）去污劑裂解：用去污劑溶解細胞膜、裂解細胞，釋放內(nèi)容物；用于組織細胞

    （4）酶裂解細胞：植物、細菌和真菌等含有細胞壁的細胞

    劇烈的蛋白裂解方法

    常用于難于破碎的細胞，如固體組織內(nèi)的細胞，或具有堅硬細胞壁的細胞，如酵母細胞。

    （1）超聲波裂解法：細胞樣品

    （2）弗氏壓碎器：高壓下迫使細胞穿過小孔徑而產(chǎn)生剪切力，從而裂解細胞；常用于含有細胞壁的微生物、藻類

    （3）研磨法：常用于固體組織、微生物；凍存于液氮中，隨后研磨成粉末

    （4）機械勻漿法：

    （5）玻璃珠勻漿法：利用劇烈振蕩的玻璃珠打破細胞壁；用于細胞懸液或微生物

    那么蛋白提取的步驟來了：

    所需器材：低溫高速離心機，勻漿攪拌器，超聲儀，真空泵，細胞掛勺等。

    所需試劑：RIPA裂解液，蛋白酶抑制劑（PMSF）,無菌PBS等。

    蛋白樣品提取

    1、細胞蛋白的提取：

    1.根據(jù)實驗需要取出需要提取的細胞培養(yǎng)板，置于冰上，用吸引器吸除上清液。PS：所有操作均應在在冰上進行。

    2.每孔細胞（六孔板）中加入 1-2ml 4℃預冷的PBS溶液。平放輕輕搖動十秒鐘清洗細胞，然后吸除洗液，共清洗洗細胞三次（目的是去除剩余的上清液），最后一次不吸除上清液。

    3. 用刮勺將細胞輕輕刮下，接著用移液器將細胞和上清液轉移至1.5ml離心管中，置入4度離心機（提前開離心機預冷），離心1.5min，棄去上清液。

    4.配置裂解液（所用裂解液為RIPA裂解液，可以使蛋白得到充分釋放），每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF 要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合）。PS：PMSF屬于蛋白酶抑制劑，可以減少蛋白質(zhì)的講解，另外的蛋白酶抑制劑還可以用cocktail，NaF，NaN3等，也可以同時加入多種蛋白酶抑制劑。

    5.將配置好的裂解液加入第3步獲得的細胞沉淀中，一般5*10^6個細胞加入100ul的裂解液，然后吹打重懸，使細胞充分裂解。

    6.用超聲儀進一步裂解細胞：將細胞放置于冰上進行超聲，一般功率選擇為15%左右，裂解時間為1分鐘（超聲2s，休息4s），當超聲一次后，離心管仍比較渾濁，可以間隔幾分鐘再次超聲。

    7.超聲結束后，將細胞于4度離心機，12000rpm離心 25min。

    8.將離心后的上清分裝轉移至1.5ml 離心管，保存于－80℃?zhèn)溆谩?br>
    2、組織中總蛋白的提取：

    1.將少量組織塊置于 1.5ml離心管中，加入500ul含PMSF的強RIPA裂解液，先用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，當組織較軟時（如腦組織），接著用1ml槍頭不斷地吹打吸取，然后用勻漿器進一步打碎組織，最后用超聲儀進行超聲裂解；當組織較韌時（如肌肉組織），可以直接用勻漿器打碎組織，最后用超聲儀進行超聲裂解。（裂解組織就是通過不同的方法讓組織塊不斷變小）。

    2.同上方法，將離心管置入 4度離心機，12000rpm離心25min，取上清分裝于1.5ml離心管中并置于－80℃保存。