隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，我們對微生物的認識逐步深入，微生物在臨床以及科研上的應(yīng)用越來越多，而微生物采樣的正確與否直接關(guān)系到微生物數(shù)據(jù)的準確性。

    因此，微生物的采樣方法就顯得格外重要。

    首先，我們需要在取樣的過程中，注意以下幾個方面：

    (1) 所有實驗用到的取樣用具必須是經(jīng)過滅菌的（如樣品袋、取樣器、采血管、試管、鏟子、匙、刀類工具等）。

    (2) 收集樣品信息，取樣前或取樣后應(yīng)在盛裝樣品的容器或樣品袋上立即貼上標簽，每件樣品必須標記清楚（例如品名、來源、數(shù)量、取樣地點、取樣人及取樣日期等）。

    (3) 請盡量將樣本分裝 3-5 份備份；建議每組取 6 個及以上重復較為合適，至少 3 個重復。

    (4) 用到谷禾取樣管的實驗樣品，可以常溫運輸；如果不用取樣管，則必須低溫-80℃保存，保存期間切忌反復凍融；低溫寄送時請將樣品置于泡沫箱中，用干冰寄送。

    然而樣品種類繁多，不同的樣品取樣有不同的方案，下面詳細介紹每類樣品對應(yīng)的取樣方案。

    環(huán)境微生物

    普通土壤

    (1)去除表面浮土、凋落物等，根據(jù)土壤情況，選擇是否過2mm篩網(wǎng)，每個樣品從3個及以上采樣點采集并混合而成，建議將樣本分裝 3-5 份備份；

    注：采樣時需注意每個采樣點的取土深度及采樣量應(yīng)均勻一致，土樣上層與下層的比例要相同。

    (2)保存于無菌離心管中，置于泡沫箱（冰袋或干冰）中，0°C以下運回實驗室；

    (3)如果條件不允許立即提DNA，可將樣品置于-80°C冰箱中保存，并通過干冰寄送至公司后提取樣品總 DNA。

    根際土壤

    根際，是指受植物根系活動影響，在物理、化學和生物學性質(zhì)上不同于土體的那部分微域環(huán)境。部分研究是針對土壤微生物與植物之間的相互關(guān)系，因此需要對根際土進行取樣。

    (1)  采集植株，去除根周較松散的土，仍附著在根系表面的視為根際土。將植物置于裝有冰袋或干冰的保溫箱中，避光條件，0℃以下運回實驗室；

    (2)準備無菌容器，將植物根系部分置于緩沖液（PBS或生理鹽水）中震蕩，震蕩時間和強度依據(jù)樣本實際情況調(diào)整，洗下根際土；

    (3)將洗滌液進行高速離心，收集土壤沉淀，若沉淀較少，也可過濾膜，同一樣方取樣的樣本進行多點等量混合；

    (4)  將樣本分裝至離心管中，密封，標記樣本信息后液氮速凍，置于-80℃冰箱保存，干冰寄送。

    水體沉積物、底泥

    采集水底沉積物5~10 g（具體深度依據(jù)實驗?zāi)康拇_定），保存于凍存管中，標記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運回實驗室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。

    活性污泥

    多點取樣并等量均勻混合至約10 ml的懸浮污泥樣本（5~10 g沉降物），保存至凍存管中，標記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運回實驗室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。

    水體

    (1) 采集水樣應(yīng)注意無菌操作，以防止雜菌混入。

    (2) 根據(jù)實驗設(shè)置，選取適當孔徑的濾膜，使用水體抽濾機抽濾 1~100 L 水體（不同水質(zhì)間差異極大），或抽濾至濾膜上可見明顯覆蓋物。

    對于渾濁水體，建議過濾前靜置分離懸浮顆粒物，先用大孔徑濾膜過濾一遍，再用小孔徑濾膜過濾。

    (3) 標記好樣本信息后液氮速凍或置于裝有干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運回實驗室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。

    注：根據(jù)水體中微生物含量不同，取樣量有所不同：污水等菌群豐富的水體用量一般為200-1000 ml，湖泊、河流等自然水體一般為 1-2 L，自來水等菌群含量較低的水體則一般為 1-5 L，海洋水體隨著地理位置、季節(jié)和取樣深度浮動較大。

    食品

    包裝食品

    盡可能取原包裝，檢驗前不要開封，以防污染。

    大塊冷凍食品，應(yīng)從幾個不同部位用滅菌工具取樣，使樣品具有充分的代表性；

    在將樣品送達實驗室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不能再凍，保持冷卻即可。

    液體食品

    通常情況下，液態(tài)食品較容易獲得代表性樣品。

    盛放在大罐中的液態(tài)食品（如牛奶、奶昔、飲料等），取樣時可連續(xù)或間歇攪拌；

    盛放在小容器的液態(tài)食品，可在取樣前將液體上下顛倒，使其完全混勻。較大的樣品要放在已滅菌的容器中送往實驗室。實驗室在取樣檢測之前應(yīng)將液體再徹底混勻一次。

    對于牛奶、葡萄酒、植物油等，常采用虹吸法（或用長形吸管）按不同深度分層取樣，并混勻。如樣品粘稠或含有固體懸浮物或不均勻液體應(yīng)充分攪勻后，方可取樣。

    半固體食品

    用無菌操作開啟包裝，此類樣品無法用吸管吸取，可用無菌勺子從不同部位挖取樣品，放入無菌盛樣容器。若樣品是粉末，應(yīng)邊取邊混合。

    固體食品

    面粉或奶粉等易于混勻的食品，其成品質(zhì)量均勻、穩(wěn)定，可以抽取小樣品（如100g）檢測。但散裝樣品必須從多個點取大樣，且每個樣品都要單獨處理，在檢測前要徹底混勻，并從中取一份樣品進行檢測。

    肉類、魚類或類似的食品既要在表皮取樣又要在深層取樣。深層取樣時要小心不要被表面污染，同時避免使之暴露在空氣當中。

    有些食品，如鮮肉或熟肉可用滅菌的解剖刀和鉗子取樣；冷凍食品可在未解凍的狀態(tài)下可用鋸子、木鉆或電鉆（一般斜角鉆入）等獲取深層樣品；全蛋粉等粉末狀樣品取樣時，可用滅菌的取樣器斜角插入箱底，樣品填滿取樣器后提出箱外，再用滅菌小勺從上、中、下部位取樣。

    注：

    · 注意不要使固體樣品過度潮濕，以防食品中固有的細菌滋生。

    · 食品如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所取樣品冷卻至0℃~4℃；若樣品是冷凍的，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)，低溫寄送。

    植物內(nèi)生菌

    植物內(nèi)生細菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，直接對植物組織樣本進行測序分析，可以研究植物內(nèi)生細菌或真菌的多樣性。

    (1)  根據(jù)研究對象選取新鮮植物組織（如果是植物根部，需去除根表粘附土壤）；0℃以下運回實驗室；

    (2)  根據(jù)組織大小剪成小塊或小段（至少兩邊不超過0.5cm），在無菌工作臺內(nèi)，用無菌水對植物組織進行洗滌30s；

    (3) 表面無菌化處理：

    第一次消毒：75%無水乙醇浸泡1min；第二次消毒：2%次氯酸鈉處理3min，轉(zhuǎn)入75%無水乙醇浸泡30s，接著用無菌水漂洗3次；

    (4)  進行核酸提取實驗或液氮速凍，放置-80℃冰箱保存。干冰寄送。

    動物腸道內(nèi)容物

    (1) 用無菌手術(shù)刀挖取（或無菌鑷子擠出，也可用無菌生理鹽水沖洗出）腸道內(nèi)容物；

    (2) 直接用谷禾取樣盒里的棉簽沾取約黃豆大小的腸道內(nèi)容物，將沾取內(nèi)容物的棉簽浸入取樣管液體攪拌洗脫內(nèi)容物進入取樣管保存液內(nèi)；攪拌約30-40s，然后丟掉棉簽，將管子蓋子擰好，快速搖晃取樣管至少30秒；

    (3) 觀察到管內(nèi)液體帶有明顯腸道內(nèi)容物顏色即取樣成功，常溫寄送。

    人和其它動物糞便

    (1) 使用前請洗凈雙手，防止雜菌干擾。將取樣管取出，擰開蓋子。

    (2) 用取樣棉簽沾取少量新鮮糞便(需要量為黃豆一綠豆大小)；如糞便較干，可先將棉簽在取樣管中浸濕后沾取；

    (3) 將沾取糞便的棉簽浸入取樣管液體攪拌洗脫糞便進入取樣管保存液內(nèi)，攪拌約30-40s，然后丟掉棉拭子，將管子蓋子擰好，快速搖晃取樣管至少30秒；

    (4) 觀察到管內(nèi)液體帶有明顯糞便顏色即取樣成功，常溫寄送。

    注：

    · 如3天內(nèi)使用過抗生素類、質(zhì)子泵類胃藥、阿片類精神藥物請停藥3天后再檢測。

    · 感冒、腹瀉或其他癥狀期間不影響取樣,拉稀或稀便可以用棉簽反復沾取糞便至取樣管。

    · 如長期便秘無排便可使用開塞露等輔助手段獲取糞便樣本。

    ·取樣無時間和飲食限制,但是取樣前最好正常飲食。

    · 完成取樣后樣本可常溫有效存儲一周,為保證檢測時效請完成取樣后盡快送回。