從上世紀90年代以來，借助病毒感染真核細胞，成為了實驗中轉移遺傳物質的重要手段。其中，由于慢病毒能感染的細胞類型廣泛（包括分裂與不分裂細胞，干細胞等），可攜帶不低于5 kb的外源基因，并具有穩定插入宿主基因組等優勢，成為目前主流的工具病毒。在一些特定的實驗中，我們需要為病毒的濃度，即滴度，進行測定。本文將為大家介紹常用的兩種滴度測定方法。

一、取舍的問題

在正式做實驗之前，不妨先問自己這個問題：到底需不需要準確地測定慢病毒的滴度？

網上一搜，可以找到許多滴度測定的方案，也有不少商品化的試劑盒。這些方案各有優劣，但基本上都有這樣一個規律：越準確，就越花時間。越省事的，就越不準確。但是，準確度對我們的實驗來說，到底有多重要呢？

這個問題的答案，其實是跟我們使用病毒的實驗目的密切相關的。如果這批慢病毒是用來建立穩定過表達編碼基因或者shRNA等細胞系的，我覺得，根本沒有必要對病毒的滴度進行細致地測定。至少我本人在這類情況下，是不測其準確滴度的。由于建立穩定細胞系，需要用抗生素篩選或者流式分選的方法，將陽性細胞挑出來，因此，即使感染效率沒有達到100%，也并不要緊。

如果你是包裝和使用慢病毒的新手，本司機建議在收了粗病毒上清后，分別在3個10-cm貼壁培養體系（或等同的懸浮培養體系）中，加入0.5、1、2 ml的病毒進行感染。最后，這其中總有一到兩個皿滿足使用，也比完整地走一套準確測定流程要省事許多。等熟練之后，大致摸清楚了自己的實驗技術，以及外源基因長度和病毒活性滴度之間的關系，就不用設3個感染梯度做實驗了。比如像基于pLKO表達shRNA這種很短的病毒基因組，在一個10-cm皿中我只加100-200 ?l。而如果是表達好幾個kb的ORF，或者整個慢病毒質粒很大，我可能會加1 ml甚至更多。

二、快速測定法

當滴度準確性并不重要時，我們可以選擇一些快速測定方案。不過，目前網上主流的實驗技術指導文章，圍繞這部分的內容都已相對陳舊。這其中包括PCR法測定病毒核酸量，ELISA法測定病毒外殼蛋白量。雖然相比我后面要講的方法要快上得多，但這些實驗一整套做下來，依然需要花費幾個小時。

我目前唯一使用的快速測定法，是用Clontech的Lenti-X GoStix試紙。它本質上也是測定病毒p24外殼蛋白量的方法，但相比傳統的ELISA法來說，可要方便不少。當然，最后得到的結果，也不如ELISA法來得準確。只不過這種不準確性，是可以接受的。

具體的實驗步驟是，在收獲病毒之前，取20 ?l 293T細胞培養上清滴到試紙上，再滴加3-4滴Chase buffer，后靜置5-10 min，等試劑均勻在試紙上展開后顯色即可。只要在T那里有條帶顯示，就證明慢病毒粗上清達到可用滴度。
三、準確測定法

目前，所有的快速測定法都是不準確的，因為它們都沒有考慮慢病毒的活性。也就是說，死病毒也會一并被測出來。在一些比較嚴格實驗中，比如用慢病毒做RNAi-screening或CRISPR-screening，由于需要嚴格控制MOI，就需要測定慢病毒的準確滴度。

1、熒光報告基因法

對于攜帶熒光報告基因的慢病毒來說，測定起來可要簡單得多。大致的實驗流程是：

    在6孔板中，均勻地種入1~3×10^5個細胞。可不等細胞貼壁，直接加入0、5、10、15、20、30 ?l粗病毒。若是純化、濃縮的病毒，則按照濃縮比例，取一點點按比例重新回去，再按上述體積加入細胞中。可加入終濃度為2-10 ?g/ml的Polybrene。每孔培養基+細胞懸液+病毒+Polybrene的總體積為1.5-2 ml。

    細胞貼壁，換液。

    第三或第四天，用流式細胞術，或者熒光顯微鏡（可用Hoechst 33342染總細胞），計算各劑量組帶熒光的細胞比例，就可以換算出原始的平均病毒滴度。如果第一天加入的病毒是稀釋過的，記得將算出來的數值再乘一下稀釋倍數。具體的公式就不用啰嗦了吧，小學初中的數學題而已。

值得注意的是，當病毒滴度較高時，很容易在高劑量組中達到100%陽性。這樣的數據是不可以參與平均滴度計算的，因為這代表著，很可能同一個細胞感染了2個甚至更多的活性病毒顆粒。事實上，當陽性細胞百分比超過50%的時候，這種多重感染的可能性就比較高了，若直接計算，就會低估實際滴度。遇到這樣的數值，剔除便是。

用什么細胞來測滴度，也是值得思考的一個問題。雖然網上許多方案用的是293T或者HCT116細胞作為宿主，但從準確度而言，我個人是不推薦的。慢病毒對不同細胞的感染能力是有區別的，而這個區別可大可小。我甚至發現，在同一個原始細胞系中分離出來的兩個單克隆，對慢病毒的敏感性還有顯著的區別。如果慢病毒是要用于諸如screening等要求高準確度的實驗，請使用待screening的細胞作為宿主來測定滴度，這樣才能保證最終測出來的活性滴度，是針對將要使用的細胞的。

2、抗生素篩選法

許多慢病毒載體并沒有熒光報告基因，只有抗性篩選標記，這時我們只能用抗生素篩選來測定滴度了。

可能有的人會問，為何要將抗生素篩選法專門拎出來說？難道跟熒光報告基因法有很大的區別嗎？

從原理上來說，兩種方法并沒有本質上的區別：它們都是計算陽性細胞的比例，從而換算原始的病毒活性滴度。但是，若細胞培養的時間較長，陽性細胞比例的變異度就會增大。

熒光報告基因法的實驗流程較短，在感染48~72小時后，待熒光基因充分表達，即可測定。 然而，抗生素法則需要等抗性基因充分表達后，再加入抗生素篩選數天，待徹底殺滅陰性細胞后，才能進行細胞計數并換算滴度。無論最開始種植的細胞數量如何一致、細胞密度如何均一，人為誤差和生物本身的變異度都是不可避免的。只要時間一長，微小的差異就會顯現出來，最終導致每一組之間換算出來的滴度數值變異度增大。

此外，高劑量的病毒會給細胞的活性帶來影響，或正面，或負面，這跟細胞本身對病毒的敏感性，以及所要表達的外源基因的性質，都有密切關系。總之，在較長時間培養的前提下，用高劑量組直接除以不加病毒的對照組得到的陽性細胞比例，不具有代表性。

Tips：在收獲粗病毒后，建議額外分裝幾支90~100 ?l小體積管，和其他分裝的大體積病毒一并置于-80℃保存。待這些小體積病毒結冰后，取出來融化，再測定滴度。這一步可以模擬一次凍融帶來的活性滴度下降，這樣最后測得的滴度才是真正具有參考價值的。