一、DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

1.溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

EDTA：

(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基);

(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。

2.溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。但當pH>12或pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。 在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6， 因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS：

SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：

(1)溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。

(2)解聚細胞中的核蛋白。

(3)SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中 (用RNase去除RNA時)受到干擾。

3. 溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：

NaAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。 所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性， 使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、 RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合.

二、提取DNA常用的方法

一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb

二.甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。

四.異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA(在異丙醇中可溶狀態)

五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應。

七.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。

三、為什么用無水乙醇沉淀DNA

用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶， 乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴)。

但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵， 最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。

四、用乙醇沉淀DNA時為什么一定要加NaAc或NaCl

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷， 減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時， 只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時， 其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。

加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理?

加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、*抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

在基因操作實驗中，磷酸鹽緩沖系統(pKa=7.2)和硼酸系統(pKa=9.24)等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2+產生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定。