PCR過程中免不了遇到各種問題，如擴(kuò)不出目的條帶、有非特異性條帶、空白對照出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠彌散或拖尾、高保真PCR出現(xiàn)突變等等。今天小編就帶大家來聊一聊PCR的常見問題應(yīng)該如何解決。

PCR實(shí)驗(yàn)包括反應(yīng)體系的配置和反應(yīng)程序，反應(yīng)體系中有模板、引物、dNTP、酶、buffer、Mg2+，反應(yīng)程序又包括預(yù)變性、變性、退火、延伸和徹底延伸。那么在PCR出現(xiàn)問題時(shí)主要是從反應(yīng)體系的各個(gè)組分和反應(yīng)程序上來進(jìn)行調(diào)節(jié)優(yōu)化。
實(shí)驗(yàn)組無擴(kuò)增條帶
(1) 引物
檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當(dāng)而降解（建議用新合成的引物進(jìn)行嘗試）；引物設(shè)計(jì)是否合理，可利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物（如果之前用過該引物，可排除引物設(shè)計(jì)問題）。
(2) 模板
長期放置、反復(fù)凍融會導(dǎo)致模板斷裂、開環(huán)或降解，應(yīng)使用新鮮制備的DNA雙鏈作為模板；模板GC含量過高會導(dǎo)致DNA的雙鏈無法打開，此時(shí)加入PCR Enhancer，可以有效降低解鏈溫度；模板為粗品，有可能是DNA未釋放出來（若樣本為植物葉片，要確保植物為非多糖多酚植物，取新鮮幼嫩的葉片，并將葉片面積剪小，如黃槍頭尖部面積大小；可適當(dāng)延長裂解時(shí)間）或存在抑制物（建議降低模板濃度，嘗試不同稀釋倍數(shù)的模板）；若模板為cDNA，要確認(rèn)逆轉(zhuǎn)錄所用RNA的純度、完整度以及逆轉(zhuǎn)錄所用的引物（若擴(kuò)增長片段，建議使用高質(zhì)量的RNA逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄時(shí)不加隨機(jī)引物）。
(3) 酶
反應(yīng)所用的酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，建議更換新酶或用另一來源的酶重新實(shí)驗(yàn)。
(4) 擴(kuò)增體系
反應(yīng)體系配制錯誤，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
(5) 反應(yīng)程序
檢查變性溫度是否準(zhǔn)確，PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，如果溫度過高，酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活，溫度過低則模板變性不徹底；若模板為酵母菌，可將預(yù)變性時(shí)間延長10min；退火溫度不合適，可對退火溫度設(shè)置梯度，摸索最佳的退火溫度；如果目的片段較長，可嘗試Touch Down 程序；檢查延伸時(shí)間是否充足。
(6) Mg2+濃度不合適
Mg2+濃度過低可影響PCR產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗；Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整Mg2+濃度。



非特異性擴(kuò)增

(1) 引物
引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。引物與靶序列有非特異性互補(bǔ)或自身聚合成二聚體，可降低引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。
(2) 模板
模板不純，被污染，需重新制備模板。
模板降解或過量，通過電泳檢查模板完整性及濃度，必要時(shí)重新純化模板。模板的使用量請參考說明書。
(3) 反應(yīng)程序
反應(yīng)程序不夠優(yōu)化。如果出現(xiàn)比目的條帶小的雜帶，可通過提高退火溫度，降低循環(huán)數(shù)調(diào)整；如果出現(xiàn)比目的條帶大的雜帶，可縮短延伸時(shí)間、降低循環(huán)數(shù)。
(4) 酶
酶量加入過多。


空白對照出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物

(1) 引物設(shè)計(jì)不合理。
擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，PCR也可以擴(kuò)增出非靶序列的序列。
(2) 看膠圖：空白對照條帶的大小是否與目的條帶一樣，空白對照條帶的亮度是否與目的條帶一樣。
若擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小與目的條帶一致，說明有污染。更換新的Mix、水或引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。空白對照條帶的亮度比目的條帶弱：可通過降低循環(huán)數(shù)使實(shí)驗(yàn)組目的條帶擴(kuò)出，而空白對照擴(kuò)不出目的條帶。


擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠條帶彌散或拖尾

(1) 膠：制膠時(shí)要使膠完全融化。
(2) 引物：檢查人工合成的引物是否因存儲條件不當(dāng)而降解。
(3) 模板：降解或過量，可通過電泳檢查模板完整性及濃度，必要時(shí)重新制備模板。模板的使用量請參考說明書。如果目的條帶較長，模板是cDNA，要確認(rèn)逆轉(zhuǎn)錄所用RNA的純度及完整度，逆轉(zhuǎn)錄時(shí)不加隨機(jī)引物重新逆轉(zhuǎn)錄。
(4) 反應(yīng)程序：反應(yīng)程序不夠優(yōu)化。退火溫度不合適，可對退火溫度設(shè)置梯度，摸索最佳的退火溫度；嘗試Touch Down 程序。
(5) 酶：酶量加入過多。


高保真PCR出現(xiàn)突變

(1)測序樣品數(shù)量：一般來說，一個(gè)樣品的測序結(jié)果不一定可靠，建議多測幾個(gè)。
(2) 突變處的測序信號：檢查測序信號是否可信，在測序反應(yīng)的開始和最后部分測序信號不太可信。
(3) 突變的具體位置和突變類型：檢查多個(gè)測序結(jié)果中突變位置是否一樣，突變類型是否一樣，如果都在同樣的位置發(fā)生了同樣的突變，則可以排除酶的原因，因?yàn)槊敢鸬耐蛔兪请S機(jī)的，不可能總在一個(gè)位置發(fā)生突變。
(4) 模板類型：若模板是質(zhì)粒，是否測過序；若模板是cDNA，有可能是cDNA本身帶有突變。
(5) 其他原因（模板反復(fù)凍融、模板長時(shí)間在紫外光下照射導(dǎo)致的模板發(fā)生突變；基因序列與NCBI上的不一致）。