【實驗目的】

（1）學會正確使用微生物實驗中常用的接種工具，掌握各種接種技術。

（2）觀察細菌的培養特征，學會判斷細菌在不同培養基上的生長狀況。

【實驗原理】

1．無菌接種技術

無菌接種技術是微生物研究中最基本的操作技術之一。所謂接種即把微生物純菌種在無菌條件下移植到適宜的培養基上，經培養獲得純培養物。因此，接種一般要求在無菌室、超凈工作臺（圖2-1）或實驗室火焰旁嚴格按無菌操作進行。根據實驗目的的不同，采用的接種方法也不同，一般可分為斜面接種、平板接種、液體接種、穿刺接種等。斜面接種：是從已生長好微生物的斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮空白斜面培養基上的接種方法。它是菌種培養的最常用方法之一。平板接種：是用接種環將菌種接至平板培養基上，或用移液管將一定體積的菌液移至平板培養基上，然后進行培養。它主要用于菌落形態觀察、分離純化菌種、活菌計數或其他試驗。

穿刺接種：是主要用于接種厭氧菌、檢查細菌的運動能力或保藏菌種的一種接種方法。接種時，將沾取菌種的接種針從半固體培養基表面向下穿刺，在接近管底處，接種針再循原路抽出。液體接種：是將斜面菌種或液體菌種接種到液體培養基中的一種方法。它用于菌種的液體培養或液體培養基中生長特征的觀察。

2．細菌培養特征觀察

培養特征是指微生物在培養基上所表現的群體形態和生長情況。在一定的培養條件下，不同的微生物培養特征各不相同，這是鑒別各種微生物的依據之一。細菌培養特征一般用固體、半固體和液體培養基進行培養觀察，其中固體培養基又分平板和斜面兩種形式。斜面培養基上的菌苔特征：自下而上在斜面培養基上劃一直線接種，經培養，不同的細菌可以呈現絲狀、刺毛狀、念珠狀、疏松狀、樹枝狀或假根狀等不同的菌苔特征。平板培養基上的菌落特征：把細菌培養在平板上，主要觀察菌落的形態、隆起及邊緣等狀況，例如菌落的大小，表面干濕程度，隆起、扁平或凹陷，粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明、半透明或不透明，顏色以及質地等，如圖2-2所示。



液體培養基中的生長特征：細菌在液體培養基中有三種生長現象。大多數細菌在液體培養基中生長繁殖后呈均勻混濁；少數鏈狀排列的細菌（如鏈球菌、炭疽芽孢桿菌）等則呈沉淀生長；枯草芽孢桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。半固體培養基中的生長特征：半固體培養基主要用于細菌動力學試驗。有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養基仍然澄清透明。

【實驗器材】

1．菌種大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Stap hyloccocus aureus）、蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）、粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）等。

2．培養基牛肉膏蛋白胨水培養基（斜面、液體、半固體）。

3．儀器和用具接種環、接種針、涂棒等接種工具（圖2-3）。試管、移液管、滴管、培養皿、培養箱、酒精燈等。



【實驗步驟】

1．斜面接種

1）貼標簽：接種前在距試管口2～3cm位置上貼上標簽，注明菌名、接種日期等。

2）點燃酒精燈。

3）手持試管：將試管放于手掌中，并用手指夾住，使兩支試管呈“V”字形。

4）接種環滅菌（圖2-4）：用火焰將接種環燒紅，然后將接種環來回通過火焰數次。



5）拔管塞：用小指、無名指和手掌拔下試管塞，并夾于手中。試管口緩緩過火滅菌，切勿燒得過燙。

6）取菌種：將燒過的接種環伸入菌種管內，先將環接觸一下沒有長菌的培養基部分，使其冷卻，再輕輕沾取少量菌體或孢子，然后將接種環移出菌種管。注意：不要使接種環的部分碰到管壁，取出后不可使接種環通過火焰。

7）接種：在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環伸入另一支待接種斜面試管。從斜面培養基的底部向上部做“之”字形密集劃線。注意：切勿劃破培養基。也可用接種針在斜面培養基的中央劃一條直線接種，可觀察不同菌種的生長特點。

8）塞管塞：取出接種環，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。注意：塞棉塞時，不要移動試管，以免試管在移動時納入不潔空氣。以上所述的無菌操作過程見圖2-5。



9）灼燒接種環：將接種環灼燒滅菌后放回原處。

10）培養：將接種好的試管于37℃培養箱中培養，24h后觀察生長情況。

3．液體接種

（1）斜面菌種接種液體培養基

1）接種前的操作：同上。

2）接種：用接種環取少量斜面菌種移入培養基容器（試管或三角燒瓶等）中，將接種環在液體表面振蕩或與容器壁輕輕摩擦，使菌苔散開。取出接種環，塞好棉塞，再輕輕搖動液體，使菌體均勻分布在液體中。

3）培養：將接種好的試管直立于37℃培養箱中培養，24h后觀察生長情況。

（2）液體培養物接種液體培養基

1）接種前的操作：同上。

2）接種：取無菌移液管（或移液器），伸入菌種管內吸取適量菌液，轉接到待接種的液體培養基內。塞好棉塞，再輕輕搖動液體，使菌體均勻分布。

3）培養：將接種好的試管直立于37℃培養箱中培養，24h后觀察生長情況。

4．穿刺接種

1）手持試管：按斜面接種法握持菌種管和半固體培養基管，靠近火焰。

2）取菌種：將接種針在火焰上燒灼滅菌，冷卻后從菌種管中挑取少許待接菌菌苔，迅速移至半固體培養基管中。

3）穿刺接種（圖2-6）：將接種針從培養基中央垂直刺入管部3/4深處，然后沿原路抽回。注意：接種針不能在培養基中左右移動，只能有一條穿刺線。



）塞管塞：試管口經火焰滅菌后，塞上棉塞。灼燒接種針。

5）培養：將接種好的試管置于37℃培養箱中培養，24h后觀察生長情況。

5．平板接種

（1）劃線法

1）倒平板（圖2-7）：將融化的瓊脂培養基冷卻至45℃左右，在酒精燈火焰旁，用右手的無名指及小指夾持棉塞，左手打開無菌培養皿蓋的一邊，右手持三角燒瓶向培養皿里注入20mL左右的培養基。將培養皿稍加旋轉搖動后，置于水平位置待凝。



2）劃線：在酒精燈火焰上灼燒接種環，待其冷卻后，以無菌操作取少量菌苔或菌液，伸入皿內，在平板上的一個區域沿“之”字形來回劃線（具體方法參見實驗9）。劃線時，使接種環在瓊脂表面作輕快滑動，切勿劃破表面。

3）培養：劃線完畢后，灼燒接種環，在皿底用記號筆注明菌種名稱、日期、姓名（或學號），將培養皿倒置放入37℃恒溫培養箱中培養。

（2）三點接種法一般用于霉菌菌落觀察的接種方法。

1）倒平板：同上。

2）三點接種：無菌操作下，用接種針從斜面取少量孢子，針尖垂直地點接在平板培養基表面上，點接三次，接種結果見圖2-8。注意：三點呈等邊三角狀，三點均位于培養皿的半徑之中心。

3）培養：將平板保持倒置狀態放入培養箱內（切忌來回翻動），適溫培養1周。

（3）涂布法

1）倒平板：同上。

2）取菌液：用1mL無菌吸管吸取經適當稀釋的菌液0.2mL于平板中。

3）涂布：用無菌涂棒在平板表面均勻涂布（圖2-9）。

4）培養：室溫下靜置5～10min后，倒置于37℃恒溫箱中培養24～48h。

【實驗報告】

1．實驗結果觀察并記錄用不同接種方法培養得到的細菌菌落形態特征，并列表比較幾種細菌的菌落特征。