什么是細胞培養？細胞培養是指從動物或植物中提取細胞，然后在人工環境中進行培養以進行科學研究。最早的細胞培養技術是在100多年前開發的，為科學的巨大突破做出了貢獻。如今，它已成為全世界實驗室用于研究細胞的生理學、生物化學、疾病潛在機制以及藥物和有毒化合物的作用的基本工具。它也可用于在藥物篩選和大規模制造生物化合物，諸如疫苗和治療性蛋白質。

細胞培養實驗室設計

任何細胞培養都需要幾個重要的注意事項。最重要的方面是維持無菌和無菌環境，以防止細胞污染。首先，應使用一個單獨的封閉房間或帶有一個進出點的實驗室。應在實驗室入口和出口附近設置帶有肥皂和消毒劑的洗手水槽，以進行手部清潔。專用細胞培養實驗室外套和安全鏡應放在實驗室入口處。層流罩和培養箱應遠離入口，以最大程度地減少污染風險。將通風櫥和培養箱放置在遠離任何空調單元的位置，以防止可能被污染的氣流進入無菌工作環境和培養箱中，這一點也很重要。應該有足夠的清潔工作表面，需要定期進行消毒，并要有足夠的存儲空間，以確保工作表面保持清潔。實驗室內所有必要的設備和消耗品均應可觸及，以防止退出和再次進入。人體工程學環境對于層流罩非常重要，因為層流罩在工作時應有足夠的空間放置物品或可移動的消耗品推車，并且易于接近培養箱，顯微鏡和離心機。

細胞培養安全

細胞培養實驗室會帶來處理和操縱細胞和組織以及有毒，腐蝕性或誘變性溶劑和試劑有關的風險。因此，遵守標準的微生物實踐和技術對于降低風險和確保安全至關重要。生物安全有四個級別，稱為生物安全級別（BSL）。每個級別都有相應的微生物標準、安全設備和設施防護措施，在處理有害生物材料和有害物質時應予以實施。BSL-1是大多數研究和臨床實驗室所共有的基本保護水平，在這些實驗室中，所使用的藥物尚無法在正常健康的人類中引起疾病。BSL-2適用于已知中度風險的藥物，已知這些中度風險的藥物通過攝入或經皮或粘膜暴露可導致嚴重程度不同的人類疾病。大多數細胞培養實驗室應至少為BSL-2，但具體要求取決于所用生物材料和所進行工作的類型。造成嚴重且可能致命感染的細胞或試劑需要BSL-3，而BSL-4實驗室則需要密閉程度最高。

以下是細胞培養實驗室的基本安全建議列表。清單不完整，應補充適當的生物安全水平建議。

始終穿戴適當的個人防護設備（PPE），包括實驗室外套，手套和護目鏡。

務必閱讀所使用的任何物質的材料安全數據表（MSDS），以確保在處理時采

適當的安全預防措施。

在實驗之前和之后對所有工作表面進行消毒。

即使沒有受到污染，也應定期清潔實驗室設備。

避免產生氣溶膠或飛濺物。

在使用有潛在危險的材料之后以及離開實驗室之前，請洗手。

在處置之前，對所有潛在的傳染性材料進行消毒。

將可能導致傳染性物質暴露的任何事件報告給適當的人員（例如，實驗室主管，安全員）。

請勿在實驗室中飲食，抽煙，吸煙，戴隱形眼鏡，涂抹化妝品或存放食物以供人類食用。

細胞培養基礎 培養條件

對于細胞存活和生長，至關重要的是培養環境盡可能復制細胞的生理環境。可以控制的培養條件包括溫度、相對濕度和二氧化碳含量，以及與培養基相關的因素，例如營養成分、pH、分子滲透摩爾濃度以及補料的體積和使用頻率。這些變量會隨時間波動，因此應對其 進行監視。

原代細胞與永生細胞

原代細胞培養是直接從完整或分離的組織或器官片段中分離并在培養皿中生長的細胞。首次將原代培養物進行傳代培養后，它就被稱為細胞系。原代細胞系的壽命有限，在達到衰老狀態（細胞分裂停止）之前只能傳代培養10至20次。

一些細胞系的壽命沒有限制，并且具有無限的增殖能力。這些細胞系被稱為連續的或永生的細胞系。細胞的永生化可以多種方式發生。癌細胞具有固有的突變，使細胞能夠不受限制地繁殖。最初具有有限壽命的正常細胞可以通過促進生長的基因突變而轉化為永生化細胞。通過化學處理或引入可激活生長促進基因的致瘤病毒，也可使在培養物中生長的正常細胞永生。

貼壁培養與懸浮培養

貼壁細胞附著于細胞培養容器表面，進行單層細胞生長。傳代時，需要使用剝離劑將其從表面剝離。傳代后幾個小時內，它們會重新附著在表面上。懸浮細胞不會在細胞培養容器的表面形成單層，而是保持懸浮狀態。細胞可能會形成團塊，尤其是高密度時。

哺乳動物與非哺乳動物細胞培養

哺乳動物細胞培養是最常見的，但是，可以培養的細胞來自多種生物細胞，例如植物，昆蟲，細菌和酵母。植物細胞培養物通常在液體培養基中作為細胞懸浮培養物或在固體培養基中作為愈傷組織培養物生長。源自果蠅（Drosophila melanogaster）或粘蟲（Spodoptera frugiperda）的細胞是昆蟲細胞系的典型實例，其分別用于生化測定或重組蛋白的表達。對于細菌和酵母菌，通常會在含有嵌入營養物的固體支持物（通常是凝膠，如瓊脂）上培養少量細胞，細胞懸浮培養需要在營養培養基的條件下進行大規模培養。

細胞生長與融合

細胞培養物的生長通常分為四個階段（如下圖2）。當細胞適應培養條件且未分裂時，就會發生滯后階段。對數階段發生在細胞生長活躍分裂時。這是細胞實驗和數據收集的最佳階段。當細胞達到對數后期時，應進行傳代培養。這是在“人滿為患”之前發生的。當細胞接近擁擠時，細胞生長會減慢。這被稱為固定相或平穩期。此階段的細胞處于細胞應激的風險中。當細胞死亡的自然過程占主導地位時，細胞群被認為處于死亡階段，也稱為衰退階段。

細胞系選擇

世界各地的實驗室中使用了成千上萬種成熟細胞系，可以從商業或非營利性供應商（細胞庫）購買。從經過驗證的細胞庫無污染的角度出發，從信譽良好的供應商那里獲得細胞系至關重要。從其他實驗室獲得細胞系具有很高的污染風險，并且缺乏細胞系驗證，因此建議您不要這樣做。

標準細胞培養方案

在所有細胞培養實驗室中都有幾種基本的細胞培養方案。熟悉并理解這些操作標準（SOP）很重要。

無菌技術

始終如一地進行無菌技術的操作可以幫助確保所有培養基和培養皿的無菌性，從而減少細胞暴露于污染物的機會，并保持培養物健康，可行和純凈。嚴格的無菌技術是成功進行細胞培養以使培養物免受微生物污染和細胞交叉污染的必不可少的先決條件。

原代細胞分離

原代細胞分離可以在多種復雜的生物學樣品上進行，包括組織（皮膚，肝臟，腫瘤，腦，肺等），骨髓，血液，脾臟和淋巴結。有許多不同的方法可以制備樣品以獲得最佳的細胞分離效果。選擇的方法取決于您的起始樣品，可能涉及從樣品中除去某些元素或僅創建單細胞懸液。從完整組織中分離細胞時，必須首先使用機械力或蛋白水解酶破壞將細胞固定在一起的細胞外基質。

原代細胞分離的基本原理要求將分離出的組織切碎或用無菌剪刀或手術刀切成2-4毫米的碎片。將薄紙片加上適當的緩沖液或平衡鹽溶液中，洗滌2-3次。根據方案添加解離酶并孵育。通過輕輕移液將細胞分散。通過細篩過濾細胞懸浮液，并洗滌2-3次。將細胞重懸于培養基中并接種。

傳代細胞

傳代培養或傳代是指稀釋已達到高度融合的細胞以使其能夠連續培養。貼壁細胞在80-90％匯合時應傳代，懸浮細胞應在細胞結塊且混濁時傳代。記錄每個細胞系的細胞傳代數非常重要。這有助于監視原細胞活力并在其達到衰老之前計劃實驗。隨著傳代次數越高，遺傳漂移越遠，它有助于監測永生細胞的年齡。不應對傳代數很高的細胞系進行實驗。

始終輕柔地處理細胞非常重要，因為劇烈或嚴厲的處理可能會導致細胞損壞或死亡。切勿用移液器直接吸取培養基或將緩沖液直接洗滌到細胞上，請始終將其輕輕地添加到容器側面，以免損壞細胞。當重懸沉淀或研磨混合細胞時，請輕柔地進行。

簡而言之，貼壁細胞的傳代培養方案如下：去除培養基，并用PBS洗滌細胞一次。加入分離劑，例如胰蛋白酶（分解使細胞粘附到血管上的蛋白質），然后將細胞在37°C下溫育直至完全分離。分離可能需要1-20分鐘，具體時間取決于細胞系。在顯微鏡下監控細胞，以確定何時發生分離。通過向細胞中添加完整的培養基使胰蛋白酶失活（血清中的胰蛋白酶含有蛋白酶抑制劑使胰蛋白酶失活），然后在離心機中離心（150–300g，3-5分鐘）使細胞沉淀。除去培養基（沉淀上部的液體），將細胞輕輕重懸在新鮮培養基中，然后將細胞以所需密度鋪在新的培養皿中。對于懸浮細胞，不需要胰蛋白酶。收集細胞并離心（在150–300g下離心3-5分鐘）形成沉淀，除去培養基，將細胞重懸于PBS中進行洗滌。在另一輪離心后除去緩沖液，將細胞重懸于新鮮培養基中，并以所需密度重新接種。

冷凍保存和復蘇

細胞系是寶貴的資源，因此保存庫存以進行長期存儲至關重要。冷凍保存是指在非常低的溫度下冷卻和保存細胞以保持其生存能力的過程。細胞庫適合在低于-130°C的溫度下長期保存。

冷凍保存培養細胞的最佳方法是在冷凍保護劑（例如DMSO）存在的情況下，將它們保存在完全培養基中的液氮中。防凍劑降低培養基的凝固點，還可以降低冷卻速度，從而大大降低形成冰晶的風險，而冰晶可能損壞細胞并導致細胞死亡。細胞應以高濃度（例如90％融合時）和最早的傳代次數進行冷凍保存。簡而言之，冷凍保存包括洗滌和沉淀細胞，將其重懸于含有DMSO（例如5％DMSO）的完全培養基中，并將細胞懸浮液轉移至1mL無菌冷凍管中。由于細胞必須緩慢冷凍，因此將冷凍管放置在可控速率的冷凍室或冷凍室中。將冷凍冷凍的容器在-50至-80°C的溫度下儲存24小時，然后將冷凍管轉移到液氮儲存器中。

確切的冷凍條件取決于使用的細胞系。檢查特定于細胞系的條件非常重要，否則冷凍的種子細胞在復蘇和再培養時可能不會產生活細胞。

為了從液氮儲存中恢復細胞系，將冷凍的小瓶在便攜式液氮容器或干冰中運輸到細胞培養區域。冷凍小管中的DMSO一旦融化，會對細胞產生毒性，因此，為確保高細胞活力，必須在37°C水浴中迅速融化細胞，并立即將其轉移到裝有預熱培養基的培養皿中。培養基稀釋了DMSO，因此細胞不再處于有毒濃度。一旦復蘇的細胞繁殖并傳代兩次，它們就可以用于實驗。比較好的作法是盡快冷凍儲存更多細胞，并更換長期存儲的細胞。