分離時選擇了合適的蛋白柱，有時往往不能成功地完成蛋白的分離，同一根蛋白分離柱在不同的使用者手中可能會有不同的柱壽命及分離效果，正確的使用蛋白柱和正確的日常維護是保證成功分離蛋白及延長柱壽命的關鍵。

不論使用什么類型的蛋白柱，首先必須對其填料的性能有基本了解。如該柱適用什么樣的溶劑，什么類型的樣品，流速及耐壓范圍等，各種類型的蛋白柱，在柱箱內均有詳細的說明書，使用柱子前，務必要仔細閱讀，以保證正確使用這些柱子。下面就蛋白分離中常出現的問題進行討論。
①樣品不保留：

在用離子交換柱分離蛋白時，流動相的pH值對保留值影響很大，當選用陰離子型蛋白分析柱時，如#####若流動相的pH值小于蛋白的pI值時，蛋白分子陽離子狀態，則在柱上沒有保留，只有當流動相的pH值大于蛋白的pI值時，蛋白分子呈陰離子，才能在陰離子交換柱上得到保留。另外，當流動相或樣品中的離子強度過大時，也會造成蛋白在離子交換柱上不保留。此外，上樣量過大，亦會使蛋白樣品保留變弱，一般樣品的上樣量不應超過該填料結合蛋白量的20%，在選用GPC柱時，應特別注意填料的孔徑及相應的可分離蛋白的分子量范圍，若蛋白的分子量超過填料的孔徑極限則蛋白樣品也不保留。在用反相色譜分離蛋白時，流動相中有機溶劑的比例會影響蛋白的保留值。有機溶劑比例過高，會使蛋白的樣品與填料的作用變弱而過早地洗脫。流動相中的三氟乙酸可作為離子對試劑和 pH調節劑，有利于蛋白的保留。

②回收率（質量回收率）低

蛋白質量回收率低往往發生在使用凝膠過濾柱時，特別是以硅膠為基質的凝膠蛋白分析柱時，盡管硅醇基已經過雙醇封口，但殘留的硅醇基仍會與蛋白的堿性基團發生非GFC效應，造成回收率低，分離度差等現象,解決這一現象的方法是在流動相（通常是水）中加入0M-0.3M鹽作為改性劑以減少這種非GFC效應。

③柱壓過高

柱壓過高的原因在于柱入口的堵塞及填料間的縫隙的減小或堵死，這些原因有：非硅膠填料的顆粒膨脹（主要是由于使用過高比例有機溶劑引起）；來自樣品，流動相的顆粒堵塞、細菌生長，流速過高等，為防止柱壓過高，應使用符合要求的流動相組成。樣品，流動相使用前嚴格過濾。為了保存時防止細菌生長。以硅膠為基質的柱子可使用20%有機水溶液保存。其它柱子在保存液中加入0。02%的疊氨鈉。

④性能改變

蛋白柱在使用一段時間后，其性能會有所改變（保留值變化，柱效下降等）。原因之一是被分離樣品中細胞碎片，類脂，酸等的污染，對聚合物基質的柱子可用0.1-1.0N NaOH溶液清洗，注意以硅膠為基質的柱子（如Protein Pak凝膠柱）不能用NaOH清洗。