近年來隨著儀器和試劑的不斷發(fā)展，幾乎所有的免疫檢測(cè)應(yīng)用都可以獲得熒光讀數(shù)。不過，盡管免疫熒光技術(shù)能夠提供靈敏而準(zhǔn)確的結(jié)果，并適合多重檢測(cè)，但優(yōu)化還是必不可少的。
操作方案要優(yōu)化

免疫熒光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌以及測(cè)定讀數(shù)。大多數(shù)研究人員的染色方案都是一成不變的，因此建議在使用珍貴的樣本材料時(shí)，花點(diǎn)時(shí)間優(yōu)化操作方案的每一步。

就一抗孵育而言，必須考慮抗體的建議稀釋度，以實(shí)現(xiàn)高的信背比。若抗體濃度過低，則熒光信號(hào)較弱，可能難以與背景區(qū)分開，但抗體濃度過高，則會(huì)導(dǎo)致較高的背景染色。千萬(wàn)不要低估各步驟之間徹底洗滌的重要性。利用生理溶液來洗滌，可去除未結(jié)合的熒光試劑，或那些只是粘在目標(biāo)上而非特異性結(jié)合的熒光試劑，從而提高信背比。

熒光試劑要放好

盡管許多熒光基團(tuán)具有相對(duì)的光穩(wěn)定性，但在保存和染色過程中若未能避光，則可能導(dǎo)致熒光基團(tuán)-抗體結(jié)合物降解，引起假陰性結(jié)果。熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護(hù)其光譜完整性。特別指出，串聯(lián)的熒光基團(tuán)對(duì)頻繁操作引起的不穩(wěn)定性特別敏感。

盡管免疫熒光技術(shù)提供了準(zhǔn)確的結(jié)果，但也存在一些缺點(diǎn)，包括自發(fā)熒光、熒光信號(hào)的淬滅，以及標(biāo)本存儲(chǔ)過程中的信號(hào)褪色。按照建議的實(shí)驗(yàn)方案來操作，研究人員可以避免一些技術(shù)上的缺陷。

選擇熒光要謹(jǐn)慎

免疫熒光技術(shù)的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)在于它為多重檢測(cè)提供了機(jī)會(huì)，如今流式細(xì)胞儀能檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中20多個(gè)離散參數(shù)。在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮每種熒光基團(tuán)的獨(dú)特性質(zhì)，如最大吸收波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。人們通常要檢測(cè)組織或細(xì)胞樣本中的多個(gè)抗原，必須選擇光譜不重疊的熒光基團(tuán)。即使是最好的檢測(cè)系統(tǒng)，也無(wú)法克服儀器和試劑之間的不匹配。

合適對(duì)照不可少

任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析都依賴于相關(guān)的對(duì)照，免疫熒光染色也不例外。不加一抗，則能說明觀察到的信號(hào)是否來源于二抗與組織或細(xì)胞樣本的非特異性結(jié)合，此外，建議使用不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞或組織作為陰性對(duì)照。同時(shí)，為了確保所有組分都正常發(fā)揮作用，那些已知表達(dá)目標(biāo)的陽(yáng)性對(duì)照也少不了。在熒光Western blot或ELISA技術(shù)中，含有目標(biāo)抗原的蛋白或肽段適合作為陽(yáng)性對(duì)照。

總之，免疫熒光染色是一種流行且強(qiáng)大的檢測(cè)方法。通過精心選擇熒光基團(tuán)，并開發(fā)可靠的染色方案，你可以生成豐富的數(shù)據(jù)。