凝膠電泳是一種常用的實驗室技術，可鑒定、定量和純化核酸片段。我們常用的是瓊脂糖凝膠電泳，可以用來分離鑒定和純化DNA片段。

將樣品上樣到瓊脂糖膠的孔內并放入電場，使帶負電荷的核酸向正極移動。蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個原理可將其分開。較短的DNA片段遷移較快，而最長的片段的遷移最為緩慢，從而實現基于DNA片段大小的分離。
 每當提取完質粒之后在鑒定檢測DNA時，制備使用瓊脂糖凝膠的過程中應該要多注意，DNA酶污染的儀器可能會使DNA降解，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現象。為了得到更好的跑膠圖，我們應該要考慮到以下幾個影響DNA分子遷移率的因素：

①凝膠濃度

對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5~2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析，但是低濃度膠易碎，為了避免此現象，我們要小心操作和使用質量好的瓊脂糖。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失的現象。

②緩沖液

在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠，電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化。

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能會使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。如圖所示：


③電壓和溫度

電泳時電場強度不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30℃。低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。若要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm，溫度應該低于15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象。

④DNA樣品的純度和狀態

注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

⑤DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。DNA上樣量大可能導致DNA帶型模糊對判斷其大小有影響，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。

⑥Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。

⑦凝膠的染色和觀察（針對用EB染色的凝膠）

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠(EB)，染色效果好，操作方便，但是穩定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合適的光源和激發波長，如果激發波長不對，條帶則不易觀察，出現條帶模糊的現象。

最后我們來分析幾個凝膠圖：

DNA如果降解或者混有其他雜質比如蛋白質、RNA的話,在電泳中我們是可以檢測到的。線性的單一DNA樣品一般是單條帶，質粒的話可能會有2-3條帶，這和DNA分子的構象有關，如圖一所示：



圖一

如果條帶變寬、變暗、或者變成彌散的DNA條帶,表示DNA非特異的降解，還有一種可能是太久沒有更換電泳緩沖液造成的。如圖二所示：



圖二

如果有蛋白質污染,上樣孔可能發亮。如圖三所示：



圖三

如果跑膠時DNA上樣量過多導致條帶寬度大，無法準確判斷其大小。

好，以上就是今天關于“影響核酸凝膠電泳結果的因素分析”的全部內容了，你看懂了么？