1.  為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？

答：可以從這幾個方面一一考慮：

（1）設計的抗原與被免疫的動物內源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質。對于前一種情況應該重新設計抗原，設計抗原時盡量選取目標蛋白特異性的序列，可以設計為短肽然后再與載體蛋白偶聯之后免疫；對于后一種情況，首先確認小分子物質是否已經正確地和載體蛋白偶聯，如果偶聯沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，一般來說KLH是所有載體中較為優先考慮的蛋白。

（2）免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果，詳細請參考本站有關動物免疫的部份，實際操作中的相關程序與本站推薦的程序相差盡里不超過50%的偏差。

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證完全有效，此時可以考慮更換佐劑嘗試。

（4）免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應答。一般來說，實際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。

（5）免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內免疫方法，具體操作本站上也有詳細的講解。

（6）測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開始作梯度稀釋。對于小分子物質，效價達到1：2000仍可視為免疫成功。

2.  為什么融合后細胞不長或者融合后克隆很少？

答：可以從這幾個方面考慮：

（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。

（2）培養基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

（3）培養基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質血清。

（4）未正確制備飼養層細胞。參見本站有關飼養層細胞制備的部份。

（5）接種雜交瘤細胞的培養板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

（6）融合后，未及時轉移或稀釋細胞。有人在做融合后喜歡把融合的細胞先放在培養瓶中培養，然后再滴到96孔板上。如果在培養瓶中培養的時間過長，也可能出現克隆利率少的情況。

（7）細胞被污染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。

（8）細胞培養條件不正確，確保細胞培養在恒定的37度較濕的環境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。

（9）其它與融合條件相關的不恰當的因素。詳見本站有關細胞融合的部份。

3.  為什么融合后得不到陽性克隆？

答：可能的原因：

（1）動物未免疫成功就進行了融合。具體解決方法參照本頁面第1個問題。

（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁面第2個問題。

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質不可以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當的二抗等諸多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份與細胞培養條件中的物質相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結構相同或類似的物質產生了競爭反應。舉個簡單的例子，如果需要制備抗BSA 的單抗，則養雜交瘤的培養基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結合，最后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

（5）其它所有能影響ELISA等相關篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關ELISA實驗的講解與討論。

4.  為什么我的細胞生長很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣質的培養耗材、培養基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養實驗，根據骨髓瘤細胞的倍增速度確實血清質量。

（2）使用的血清或培養基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。

（3）制備飼養層的方法不正確。參見本頁面第二個問題。

（4）其它問題，可以參考本頁面第二個問題。

5.  我的克隆原來是陽性的，為什么后來轉為陰性了？

答：首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩定的，確實容易發生染色體丟失的情況，尤其是當細胞移到新環境中生長，如從小孔擴大到大孔，或者復蘇操作時，更容易發生陽性變為陰性。但是也有一些辦法盡量減少陽性變為陰性的辦法。一般可以從這幾個方面加以注意：

（1）永遠保證細胞處在最佳的生長環境中。尤其是培養基不能長期不換，一般來說，當細胞增長到一定密度的時候，培養基就開始變顏色，這個時候就要準備換培養基了，除了換培養基，同時應該控制好細胞的密度，可以吹走過多的細胞，使新加入的培養基不至于很快被消耗。

（2）對于重要的細胞株，每一步都把陽性的細胞保種。

（3）不要過于頻繁操作細胞，當細胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞容易出現死亡或者生長形態發生明顯變化。

（4）對于傳代次數較多的細胞株需要經常進行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。

（5）當細胞被支原體等微生物污染，也會發生由陽性轉為陰性的情況。

6.  為什么我做亞克隆后長不出克隆來？

答：亞克隆失敗的原因和克隆不長的原因類似，但是除此之外，也還有一些獨特的原因。

（1）亞克隆時，原始孔里的細胞狀態不好，經過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至于長不出克隆。

（2)亞克隆時，沒有按照正確的數量取出細胞，在本站有關亞克隆操作的頁面上提到過，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，或有效細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，則也可能出現長不出克隆的結果。

（3）未添加飼養層細胞。單個細胞在完全培養基中極難培養，如果不添加飼養層細胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的，但是HT確實可以加快細胞生長，改善細胞生長狀態。

（5）使用無血清培養基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養基制備單抗，但是在某些血清可能干預篩選步驟的實驗的時候，可能會選用無血清培養基來培養雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養基中，單個細胞是很難長成克隆的。最/好的解決辦法就是先用含有血清的培養基培養它們，等克隆長出后再把培養基徹底更換為無血清培養基。

7.  為什么我凍存的細胞很難復蘇或者復蘇不活？ 

答：這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復蘇問題。 對于凍存過程，需要注意：

（1）凍存液的配方。這個問題很關鍵，一個良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細胞傾刻死亡。目前認為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養過雜交瘤的培養基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞最終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細胞中毒而亡。如果使用第二個配方，注意一定要用養過雜交瘤的培養基，而盡量不要用一般的完全培養基，而且一定是配養需要凍存的那一株的培養基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長自己沒有親自試過，不發表評論。如果新手確實對這個沒把握，市場上也有商品化的凍存液，買回來按照說明書操作就OK了。

（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，復蘇成活的機會就明顯會下降。

（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細胞是最理想的。如果條件簡易，可以把細胞放在4 ℃半小時左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時，最后轉入-80 ℃放置過夜，最終轉入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現在市場上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然后直接放-80 ℃就行，等時間夠長后直接轉至液氮中即可。

（4）細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實這是錯誤的。有人認為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會進入凍存管，最終可能造成細胞污染。

（5）保證被凍存的細胞處于良好的生長狀態，并且沒有被污染。 

對于復蘇過程，需要注意：

（1）快速。為了防止升溫中細胞內產生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復蘇，并不斷晃動凍存管。

（2）復蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復蘇的細胞被污染。

（3）有的人復蘇細胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養體系里，容易對細胞造成毒害，因此強烈建議將融化的細胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養基重懸，再接種到新的容器內培養。

8.  為什么我的細胞總是污染？如何可以救活污染的細胞？

答：養細胞出現污染，幾乎是每個細胞培養技術員容易出現的問題。要防止細胞污染，無非就是保證培養環境無污染，保證所用的所有試劑都無污染源，同時提高操作時的警惕性，這些基本的知識這里就不再廢話了。