一、糖類代謝試驗

1.1 糖（醇）類發酵試驗

不同細菌含有發酵不同糖（醇）的酶，因而發酵糖（醇）的能力各不相同。即使某些能發酵同樣的糖（醇），但其產物也不同，有的產酸產氣，有的產酸不產氣，可根據這些特點來鑒別細菌。

大致可分為：

液體發酵管：無糖肉湯或蛋白胨水中，加入1%糖（醇）類指示劑，一支小玻管，經滅菌后備用。若被檢細菌對營養要求較高時，則在試驗前加入2%~5%無菌血清。

半固體發酵管：在液體糖（醇）發酵培養基中，加入0.3%~0.5%瓊脂，溶化后分裝試管，滅菌后讓試管直立，使瓊脂凝固，做成高層培養基，接種細菌應用接種針穿刺接種。

固體發酵管：此類培養基一般不常用，僅用于營養要求較高的某些細菌，在含糖類及5%~10%血清瓊脂斜面上進行發酵試驗。另外固體高層糖發酵管，可用于厭氧細菌糖發酵試驗，如產氣莢膜桿菌在含糖的固體高層發酵管中出現洶涌發酵（產生大量氣體）。

雙糖（或三糖）高層斜面發酵管：這種培養基含有葡萄糖和乳糖（或再加蔗糖），這兩種糖（或三種糖）混在一起，制成高層斜面，其中葡萄糖和乳糖（或蔗糖）比例為1:10。

各種糖（醇）發酵管含糖（醇）的濃度，一般為0.5%~1%，有時可達2%。經121℃20~30min滅菌，容易水解變質，特別是在堿性溶液中更易破壞。

故糖（醇）發酵培養基常用高壓蒸115℃15min滅菌。

應用的糖（醇）種類很多：

單糖：葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木膠糖、半乳糖；

雙糖：乳糖、麥芽糖、蔗糖、覃糖；

多糖：菊糖、肝糖、糊精、淀粉；

醇：甘露醇、衛矛醇、山梨醇、側金盞花醇、肌醇、丙三醇（甘油）；

糖苷：水楊苷等。

最常用的指示劑有酚紅、溴麝香草酚藍、溴甲酚紫、酸性復紅。

前兩者顏色反應較敏感，但穩定性差，后二者比較穩定。特別是一些遲緩發酵的細菌，培養時間長，應用后二者指示劑。

酚紅pH6.8（黃色）~pH8.4（紅色）

1.2 甲基紅試驗（methyl red）

甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4（紅色）~pH6.2（黃色），產氣腸桿菌分解葡萄糖產生丙酮酸，但又很快將丙酮酸脫羧，轉化成醇等物質，則培養液的pH值仍在6.2以上，故此時加入甲基紅指示劑，培養液呈黃色，此為陰性對照菌。陽性對照菌是大腸埃希氏菌，呈現紅色為陽性。

1.3 V-P試驗

伏-普試驗，目的是檢查細菌是否能分解葡萄糖，產生乙酰甲基甲醇。

陽性對照菌是產氣腸桿菌，分解葡萄糖（被檢細菌接種到葡萄糖蛋白胨水中，36℃18~24h）產生丙酮酸，再將丙酮酸脫羧形成乙酰甲基甲醇，在堿性條件下（乙液-40%KOH溶液），被氧化為二乙酰，與培養基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基結合，通常在10min內形成紅色化合物。

若不顯色，放置于50℃水浴2h，或放置于37℃培養箱中4h，充分搖動，觀察培養液反應結果，不顯紅色為陰性，陰性對照菌是大腸埃希氏菌。

1.4 ONPG試驗

鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷的縮寫，利用該試劑可以檢查被檢細菌有無β-半乳糖苷酶和滲透酶，發酵乳糖的細菌具有這兩種酶。

滲透酶將乳糖分子帶入菌細胞內，而β-半乳糖苷酶可將乳糖的β-半乳糖苷鏈切斷，產生葡萄糖和半乳糖。

遲緩發酵乳糖的細菌，缺乏滲透酶，而ONPG滲入菌細胞內，被β-半乳糖苷酶分解產生鄰位硝基苯酚，一般在20~30min內顯黃色，為陽性，對照菌為枸櫞酸鹽桿菌和亞利桑那菌。

方法：將被檢細菌接種到1%的乳糖肉湯瓊脂培養基上，37℃培養過夜。取菌苔接種于0.25ml生理鹽水中做成懸液。加入1滴甲苯，并充分振搖，使酶釋放。在懸液中再加入ONPG液0.25ml，混勻，置于37℃培養箱或水浴箱中，分別在20min和3h后觀察培養液反應結果不出現黃色者為陰性，對照菌是沙門氏菌。

1.5 氧化發酵試驗

測定糖類的氧化或發酵及糖類未被利用的代謝類型。

氧化型：細菌在分解葡萄糖過程中，必須有氧分子參加。無氧環境中不能分解葡萄糖。

發酵型：在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解。發酵型細菌無論在有氧或無氧的環境中都能分解葡萄糖。

產堿型：不分解葡萄糖的細菌。

將待檢菌同時穿刺接種兩支HL培養基，其中一支培養基滴加無菌的液體石蠟油，高度不少于1cm，37℃培養48h或更長，觀察反應結果。

培養基變黃色為產酸。

兩支培養基均產酸為發酵型細菌，僅不加石蠟的培養基產酸的是氧化型細菌，兩支培養基均不變化的為產堿型細菌。

二、蛋白質、氨基酸及含氮化物代謝試驗

2.1 苯丙氨酸脫氨酶試驗

原理：某些細菌具有苯丙氨酸脫氨酶，可使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與三氯化鐵發生螯合作用，形成綠色絡合物。

方法：將被檢細菌的斜面培養物（先增菌）大量移種到苯丙氨酸瓊脂斜面上，37℃培養18-24h，再從斜面上滴加10%三氯化鐵溶液4-5滴，使其自斜面培養物上緩緩流下，觀察結果。

結果：溶液出現綠色為陽性，對照菌是變形桿菌；不變色為陰性，對照菌是產氣腸桿菌。

2.2 脫羧酶試驗

原理：某些細菌具有某種氨基酸的脫羧酶，可使氨基酸脫去羧基產生胺和二氧化碳，胺使pH值>7，此時指示劑溴麝香草酚藍由綠色變為藍色。

溴麝香草酚藍酸性顯黃色，堿性顯紫色。

方法：將被檢細菌接種到兩支脫羧酶培養基中，其中一支不加氨基酸，另一支加賴氨酸/精氨酸/鳥氨酸，再在培養基上覆蓋一層滅菌的液體石蠟，37℃培養18-24h，觀察結果。

結果：兩管培養基均含有葡萄糖，產酸，溴麝香草酚藍由藍變黃。含有氨基酸的一管出現脫羧基降解作用，產生堿性反應，溴麝香草酚藍再由黃變藍，為陽性。

鳥氨酸陰性對照菌為陰溝腸桿菌，顯黃色。

2.3 靛基質（吲哚）試驗

原理：某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，產生靛基質（吲哚），靛基質與對二甲氨基苯甲醛結合，形成玫瑰紅色化合物。

方法：將被檢細菌接種到胰蛋白胨水培養基中，37℃培養24-48h后，滴加數滴試劑于培養基液面，輕輕搖動（不可劇烈振動），觀察結果。

結果：出現紅色為陽性，對照菌是大腸埃希氏菌；出現黃色為陰性，對照菌是產氣腸桿菌。

2.4 硫化氫試驗

原理：某些細菌能分解含硫的氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸等），產生硫化氫，硫化氫與培養基中的鉛鹽或鐵鹽反應，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵。

方法：將被檢細菌以接種針穿刺接種于醋酸鉛或雙糖鐵培養基（乳糖+葡萄糖）中，37℃培養24h，觀察結果。

結果：有黑色出現為陽性。

說明：在硫化氫試驗的培養基加入硫代硫酸鈉的作用是還原作用，以保持培養基處于還原狀態，是產生的硫化氫不被氧化。

產硫化氫較少的菌種可在試管口放置醋酸鉛試條。

2.5 尿素酶試驗

原理：某些細菌具有尿素酶，在含有尿素的培養基中，分解尿素產生氨，使培養基呈堿性，此時培養基中的酚紅指示劑顯紅色。

方法：將被檢細菌接種的尿素固體斜面培養基上，36℃培養4h檢查一次，再每天檢查一次，培養5天，觀察結果。

結果：出現紅色為陽性，對照菌為變形桿菌；變色為陰性，對照菌是大腸埃希氏菌。

三、枸櫞酸鹽利用試驗

原理：枸櫞酸鹽培養基系一綜合性培養基，其中枸櫞酸鈉為碳的唯一來源，磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細菌能利用枸櫞酸鈉為碳源，能在培養基上生長，并且能分解枸櫞酸鹽，最后產生碳酸鹽，使培養基變為堿性。培養基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變為深藍色。不能利用枸櫞酸鹽為碳源的細菌在該培養基上不生長，培養基不變色。

方法：將被檢細菌的菌懸液（挑取菌苔后，洗至生理鹽水中）接種到枸櫞酸鹽培養基上，37℃培養24h，觀察結果。

結果：培養基上有菌生長，培養基變為深藍色為陽性，對照菌是產氣腸桿菌；若培養基不變色，則繼續培養7天，培養基仍不變色者為陰性，對照菌為大腸桿菌。

四、呼吸酶類試驗

4.1 氧化酶試驗

原理：某些細菌具有氧化酶，能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺試劑氧化（先使細胞色素C氧化，電子傳遞體）成紅色醌類化合物。

方法：取白色潔凈濾紙蘸取待測菌落，加鹽酸二甲基對苯二胺溶液1滴；Ewing氏改進法，再加α-萘酚溶液1滴。

結果：陽性者立即出現粉紅色，并逐漸加深，變為淡紫色，再到深紫色，Ewing氏改進法陽性于0.5min內呈現鮮藍色，對照菌為綠膿桿菌（銅綠假單細胞菌）；陰性者顏色無變化，Ewing氏法陰性為2min內不變色，對照菌為大腸桿菌。

1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液要避免接觸含鐵物質，防止出現假陽性反應。此試劑應少量新鮮配制，于冰箱內避光保存，也可購置氧化酶試條。

該實驗用于分辨革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科（陰性）與弧菌科（陽性）。

4.2 觸酶活力試驗

原理：具有觸酶的細菌能催化過氧化酶，放出生態氧，繼而形成氧分子，出現氣泡。

方法：取3%過氧化氫0.5ml，滴加到不含血液的被檢細菌瓊脂培養物上，或滴加到不含血液的肉湯培養物中，觀察結果。

結果：培養物出現氣泡者為陽性。

說明：過氧化氫濃度過高（30%）會產生氣泡出現假陽性；血液中含有觸酶，容易出現假陽性。

4.3 硝酸鹽還原試驗

原理：某些細菌能將培養基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再與α-萘胺結合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸（紅色）。

方法：將被檢細菌接種于硝酸鹽培養基中，37℃培養1~4天，每天吸取培養物2ml，加甲液（對氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g，5mol/L醋酸100ml）各數滴，同時以為接種細菌的培養基作對照，觀察結果。

結果：出現紅色為陽性。

說明：亞硝酸鹽在自然界分布很廣，容易污染試劑，硝酸鹽不純或保管不妥也可能含有亞硝酸鹽，因此必須做空白對照；繁殖迅速而還原硝酸鹽能力強的細菌如果培養時間過久，可能將亞硝酸鹽全部分解為氨和氮，出現假陰性反應，故需每天試驗，空白對照。

五、毒性酶類試驗

5.1 溶血試驗

原理：某些細菌在代謝過程中，產生溶血素，能使人或動物的紅細胞發生溶解。

方法：

1）平板法：將被檢細菌接種到血液瓊脂平板培養基上，37℃培養24h。

2）試管法：取被檢細菌16-18h肉湯培養物若干，加等量經生理鹽水洗滌三次的2%羊紅細胞懸液，置于37℃水浴箱中，30min后觀察結果。

結果：

1）平板法：若菌落周圍出現透明的溶血環，為完全溶血（β溶血），菌落周圍出現綠色溶血環，為不完全溶血（α溶血），無溶血環為不溶血（γ溶血）。

2）試管法：液體澄清透明為溶血，陽性。

5.2 鏈激酶試驗

原理：A群鏈球菌在代謝過程中，產生鏈激酶，能激活血液中的纖維蛋白酶原為溶纖維蛋白酶，促使纖維蛋白凝塊溶解。

方法：取血漿0.2ml，放入滅菌小試管中，加無菌生理鹽水0.8ml，再加被檢細菌18-24h肉湯培養物0.5ml，充分混勻后，再加入0.25%氯化鈣水溶液0.25ml，置于37℃水浴中，觀察結果。

結果：10min內血漿先凝固，而后又開始溶解，溶解時間與鏈激酶含量成正比。鏈激酶含量多時，20min內凝固的血漿完全溶解。如無變化，應在水浴中持續2h、24h，分別觀察結果。血漿凝塊完全溶解者為陽性，時間越短表明毒性越強。24h血凝塊仍不溶解者為陰性。

5.3 血漿凝固酶試驗

原理：某些細菌能產生血漿凝固酶，分兩種，一種結合在細菌細胞壁上，遇到血漿直接作用于血漿的纖維蛋白，使細菌凝成顆粒狀，使用玻片法；另一種分泌到細菌細胞外，稱為游離血漿凝固酶，能使血漿中的纖維蛋白原變為纖維蛋白，使用試管法試驗。

方法：

1）玻片法：取生理鹽水2滴，分別滴于載玻片上，以接種環挑取被檢細菌菌落，放在2滴生理鹽水中，研磨成濃菌懸液。在1滴懸液中加1滴未稀釋的血漿，另一滴加入1滴生理鹽水作為對照，迅速搖動，觀察結果。

2）試管法：取3支小試管，每支加1:4稀釋的新鮮血漿0.5ml，其中1支加被檢細菌生理鹽水懸液或肉湯培養物0.5ml，另一支加陽性菌株生理鹽水懸液或肉湯培養物0.5ml作陽性對照，再一支加生理鹽水或肉湯培養液0.5ml作陰性對照。3支試管置于37℃水浴箱中，每隔30min觀察一次結果。

結果：

1）玻片法：若在加血漿的1滴中迅速出現凝固顆粒，在加生理鹽水對照的1滴中未出現凝固顆粒，為陽性；若超過2min才開始出現凝固顆粒者不作陽性（多為非致病性）。

2）試管法：6h內，若試驗管和陽性對照管出現凝固，陰性對照管不出現凝固，為陽性；多數陽性細菌在0.5-1h內發生凝固。

六、嗜鹽試驗

原理：在高于3%的氯化鈉培養基上不生長或生長不好，但能在無言培養基上生長的，稱為非嗜鹽菌，如腸桿菌科。能在3%-6%氯化鈉培養基上生長，但在無鹽培養基上不生長，稱為嗜鹽菌，如副溶血性弧菌。在無鹽和高鹽培養基上均能生長，但長得不茂盛，稱為耐鹽菌，如葡萄球菌、銅綠假單細胞菌。

方法：取被檢細菌分別接種到1支無鹽葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化鈉葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養6-24h，觀察生長情況。

結果：培養物出現渾濁生長為陽性。