1. 蛋白結(jié)構(gòu)

a) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)及疏水氨基酸的相對(duì)數(shù)目對(duì)蛋白質(zhì)的聚集速率和聚集體的穩(wěn)定性有較大的影響。疏水氨基酸會(huì)形成聚集傾向區(qū)域(aggregation-prone region),在特定位置引入一個(gè)新的或不同的疏水氨基酸會(huì)顯著加快蛋白聚集速率。

b) 糖基化對(duì)于許多蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要意義,如CH2結(jié)構(gòu)域的糖基化可以穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域及整個(gè)單抗分子。因此去糖基化可能會(huì)干擾單抗的三級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而加速熱誘導(dǎo)聚集。甚至蛋白質(zhì)中糖的結(jié)構(gòu)也會(huì)因?yàn)楦淖兊鞍踪|(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性而對(duì)蛋白質(zhì)的聚集產(chǎn)生影響。

c) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)聚集過(guò)程中也會(huì)發(fā)揮一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)凍干誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集與β-折疊結(jié)構(gòu)有關(guān),而與非極性表面積無(wú)關(guān)。同時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)影響巰基-二硫鍵的交換速率,進(jìn)而引起分子間形成二硫鍵而導(dǎo)致聚集。

d) 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的聚集也有一定的影響。盡管聚集傾向區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)聚集有重要的影響,但若它們被適當(dāng)?shù)陌?也依舊會(huì)減小蛋白質(zhì)的聚集。 2. 化學(xué)降解

蛋白質(zhì)會(huì)經(jīng)歷多種化學(xué)降解途徑,盡管許多降解途徑(如氧化、二硫鍵還原、脫氨基等)并不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,然而研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)降解可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性或膠體穩(wěn)定性從而影響蛋白質(zhì)的聚集。如蛋白質(zhì)的氧化會(huì)增加聚集傾向,糖基化可將正的表面電荷轉(zhuǎn)變?yōu)橹行曰蜇?fù)電荷,進(jìn)而增加其疏水區(qū)域的暴露而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集,然而廣泛的糖基化則又會(huì)保護(hù)蛋白減少聚集體的形成。

3. 溫度

溫度通過(guò)影響蛋白質(zhì)溶液的性質(zhì)而影響蛋白質(zhì)聚集,其中包括影響蛋白質(zhì)的擴(kuò)散速率、蛋白-蛋白相互作用、蛋白/聚集體溶解性、構(gòu)象穩(wěn)定性及化學(xué)降解等。溫度的升高可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分解折疊的比例的增加、增加蛋白質(zhì)擴(kuò)散和碰撞速率而加速蛋白質(zhì)的聚集。同時(shí),降低溫度也可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊,進(jìn)而也會(huì)增加蛋白質(zhì)的聚集。如核糖體蛋白L9在25oC時(shí)變性程度為36%,而在4oC時(shí)該值達(dá)76%。

4. 溶液條件

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性強(qiáng)烈地依賴(lài)于溶液條件。其中一個(gè)關(guān)鍵條件是溶液pH,其可以影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象和膠體穩(wěn)定性,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的聚集。改變?nèi)芤旱膒H可以改變蛋白-蛋白相互作用的性質(zhì)和程度、蛋白質(zhì)聚集體的溶解性、以及成核和聚集體生長(zhǎng)的速率。

另一個(gè)重要的溶液條件是離子強(qiáng)度,離子強(qiáng)度通過(guò)影響蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性以及蛋白-蛋白相互作用而影響蛋白質(zhì)的聚集。溶液離子強(qiáng)度的影響通常取決于溶液的pH。

此外,溶液中的陰陽(yáng)離子可以通過(guò)與蛋白分子的特異或非特異性相互作用而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的聚集。在一些情況下,溶液中的陰離子會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的聚集具有更大程度的影響。陰陽(yáng)離子對(duì)聚集影響的差異可能是由于陰離子與蛋白質(zhì)中陽(yáng)性集團(tuán)具有較高的結(jié)合傾向。陰離子的影響程度會(huì)在一定程度上受極化程度、蛋白溶液條件的影響。

除此之外,一些輔料或添加劑也常被用于減弱蛋白質(zhì)的聚集。然而,一些公認(rèn)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑在一定條件下也會(huì)引起蛋白質(zhì)的聚集。如研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在高濃度(> 500 mM)下會(huì)形成分子簇,并會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白質(zhì)表面的水分子,故而會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。表面活性劑如PS由于降解會(huì)形成與蛋白質(zhì)相互作用的不可溶脂肪酸、過(guò)氧化物、聚氧乙烯等而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。

5.生產(chǎn)過(guò)程

a) 凍融

凍融會(huì)引起許多蛋白質(zhì)的聚集。這是低溫導(dǎo)致的變性/結(jié)構(gòu)擾動(dòng)、冰導(dǎo)致的蛋白吸附/變性、組分的選擇性結(jié)晶等一種或多種因素影響的。凍融的速度也會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和聚集傾向。

b) 攪拌

攪拌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集主要?dú)w因于以下一種或多種因素:更多氣液界面的形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸附/解折疊/聚集、剪切力、暴露于疏水表面(如攪拌棒上)、簡(jiǎn)單磨損等。剪切力導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集體會(huì)因?yàn)椴煌募羟袟l件而產(chǎn)生不同的形貌。研究表明,搖晃小瓶中凍干的IgG1單抗會(huì)導(dǎo)致亞可見(jiàn)顆粒的增加及長(zhǎng)期物理穩(wěn)定性的降低。

c) 泵送(pumping)

在樣品處理過(guò)程中使用泵時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的潛在剪切力、加壓/卸壓、蛋白磨損等,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白聚集。盡管研究表明一些蛋白質(zhì)可以容忍一定程度的剪切力,但是剪切力也常常是導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生顆粒、纖維化的原因。此外,泵送過(guò)程中的卸壓可能會(huì)產(chǎn)生氣泡,其也會(huì)加劇蛋白質(zhì)的聚集。

d) 光照

光照可在蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)多種光解和非光解的產(chǎn)物,這些降解產(chǎn)物中可能包括具有增強(qiáng)聚集傾向的聚集體或單體。研究表明,在某些情況下,抗體溶液暴露在紫外線或可見(jiàn)光下會(huì)形成高分子量聚集體。

e) 凍干

凍干過(guò)程會(huì)移去部分的蛋白質(zhì)水化層,這會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。許多蛋白質(zhì)在傳統(tǒng)的凍干或噴霧干燥過(guò)程中會(huì)形成聚集體,但相關(guān)機(jī)理尚未明晰。

f) 其他操作

除此之外,其他操作,如超聲或使用經(jīng)輻射滅菌的注射器也可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。前者會(huì)因?yàn)闅庋ā⒙晧夯蚓植繙囟壬叩葘?dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊和聚集;后者會(huì)因?yàn)檩椛錅缇^(guò)程中產(chǎn)生的自由基在蛋白質(zhì)長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程中會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集體或顆粒的形成。

6. 潛在的污染物

許多來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程或原材料中的潛在污染物也會(huì)影響蛋白質(zhì)的聚集傾向。如生產(chǎn)設(shè)備或原材料中的殘留金屬污染物會(huì)引起一些蛋白質(zhì)和多肽的聚集。殘留的消毒劑,如次氯酸、過(guò)氧乙酸可以氧化蛋白質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。